Summary
In deze video laten wij u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketen-complexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van gel-activiteit assays.
Abstract
Mitochondriën zijn cytoplasmatische organellen die een primaire rol in de cellulaire metabolisme en homeostase hebben, de regulatie van de cel signaleringsnetwerk, en geprogrammeerde celdood. Mitochondria produceren ATP, reguleren van de cytoplasmatische redox staat en Ca2 + saldo, catabolize vetzuren, synthese van heem, nucleotiden, steroïde hormonen, aminozuren, en helpen monteren ijzer-zwavel clusters in eiwitten. Mitochondriën hebben ook een essentiële rol in de productie van warmte. Mutaties van het mitochondriaal genoom oorzaak verschillende soorten van de menselijke aandoening. De accumulatie van mtDNA mutaties correleert met het ouder worden en is vermoedelijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van kanker te hebben. Door hun uiterst belangrijke rol in alle celtypes, moet de functie van mitochondriën ook kritisch zijn voor stamcellen. Belangrijke vooruitgang geboekt in onze kennis van stamcellen levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie capaciteit. Maar de functionele activiteit van stamcellen, in het bijzonder hun energie-status, was nog niet in detail bestudeerd. Bijna niets is bekend over de mitochondriale eigenschappen van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en hun gedifferentieerde voorloper nageslacht. Een manier om te begrijpen en evalueren van de rol van mitochondriën in hESC functie en ontwikkelingsmogelijkheden is om rechtstreeks de activiteit van de mitochondriale ademhaling complexen. We beschrijven hier een hoge resolutie duidelijk inheemse gelelektroforese en vervolgens in de gel-activiteit visualisatie als een methode voor het analyseren van de vijf ademhalingsketen complexen van hESC 's.
Protocol
Hoge resolutie Clear native Gel Electophoresis (hrCNE) voor mitochondriële complex In-Gel Activity Assays
Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) werden gehouden op een monolaag van ˠ-bestraalde of mitomycine C-behandelde muis embryonale fibroblasten (MEF), daarna overgestapt naar groei op Matrigel gedurende 5 dagen in de MEF-geconditioneerd medium met behulp van standaard voorwaarden. Voor het verwijderen van verontreiniging MEFs, werden hESC 's opnieuw uitgeplaat op Matrigel en gekweekt in MEF-geconditioneerd medium voor een extra 3 dagen. Immunofluorescentie microscopie voor pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 werd gebruikt om het gebrek aan differentiatie hESC te bevestigen.
- Was de cellen met warm 1x PBS, pH 7,4, gevolgd door behandeling met trypsine (1ml van 1x per trypsine goed in een 6-wells plaat) gedurende 5 minuten.
- Voeg een gelijk volume van verse trypsine-remmer (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Oogst cellen en centrifugeer bij 200 g, 5 min, kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 0,8 - 1.7ml (op basis van de grootte van de cel pellet) van ijskoude mitochondria isolatie buffer (83mm sacharose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) met een vers bereide 'proteaseremmer Cocktail. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Dounce cellen met een homogenisator (~ 40 tot 50 slagen). Vlek een hoeveelheid van de dounced cellen met trypan blauw om te controleren op volledigheid van homogenisering met behulp van een lichtmicroscoop.
- Centrifugeer bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C om een ruwe mitochondriaal pellet dat bevat ook kernen en grotere cel fragmenten te verkrijgen. Giet Verwijder de bovenstaande vloeistof en wegen de neergeslagen ruwe mitochondriale pellet. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C volgende instant bevriezen in vloeibare stikstof of dit een stopplaats.
LET OP: Differentiële centrifugering of andere gradiënt-gebaseerde procedures kunnen worden gebruikt voor het isoleren en het verzamelen van een pure mitochondriale membraan fractie. Zie ref. 4 voor meer informatie. Deze alternatieve benadering levert het mitochondriale complex activiteit per mg van de mitochondriale eiwit in plaats van complexe activiteit per mg van de cel gewicht of aantal cellen. De concentratie van mitochondriale eiwitten zal moeten worden bepaald na zuivering om deze vergelijking te maken. Ook kan een andere isolatie buffer nodig zijn voor deze aanpak. Voor solubilisatie van de zuivere mitochondriale membraan fractie, zie de opmerking volgende stap 6 hieronder. - Solubiliseren de ruwe mitochondriale pellet op ijs en door vortexen met ijskoud solubilisatie buffer (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2mm 6-aminohexanoic zuur). 6-aminohexanoic zuur kan worden vervangen door de 1x proteaseremmer Cocktail. Het gebruik van 35μl solubilisatie buffer per 20mg van pellet gewicht. Voeg 20μl van 10% w / v digitonine per 20 mg pellet gewicht en meng door de knop de buis. Incubeer gedurende 5-10 minuten op het ijs. Dodecyl-BD-maltoside of triton X-100 kan worden vervangen voor digitonine aan de eiwitten lossen. De keuze van het wasmiddel en de hoeveelheid kan invloed hebben op de vorming van supercomplexes of multimere vormen van mitochondriale complexen. Voor meer informatie, zie ref.1.
OPMERKING: De hoeveelheid wasmiddel nodig is om een zuivere mitochondriale membraan fractie solubiliseren komt overeen met een detergent / eiwit-verhouding gewicht variërend van twee-6g / g. De optimale verhouding tot mitochondriale membranen solubiliseren is 2,5 g / g voor dodecyl-BD-maltoside, 3g / g voor triton X-100, en 6g / g voor digitonine. - Centrifugeer de opgeloste pellet bij 100.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Vang het heldere supernatant.
- Voeg laadbuffer tot een uiteindelijke 5% w / v glycerol en 0,01% w / v Ponceau S (gebruik een 50% w / v glycerol, 0,1% w / v Ponceau S laadbuffer voorraad-oplossing).
- Laad gel putten met een volume dat 20-40mg van de ruwe mitochondriale pellet per rijstrook bevat. Gebruik een acrylamide gradiënt gel (4 -13%) met een 3,5% stacking gel.
LET OP: Gel elektroforese voorbereiding en voorwaarden:
Voor de gel bereiding, gebruik maken van een acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mix als volgt: 48 g van acrylamide en 1,5 g van bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Waar T is totale concentratie van AA en bisAA en C is het percentage van de crosslinker (bisAA) om de totale monomeer).
Gel buffer (3 '): 1.5M 6-aminohexanoic zuur; 75mm imidazool, pH 7,0
| Gradiënt gel: | 4% | 13% | Stapelen gel: | 3,5% |
| AA / bisAA 3 mix | 2 ml | 6,5 ml | 0,6 ml | |
| Gel buffer 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | 2,7 ml | |
| Glycerol | 5 g | |||
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | 4,7 ml | |
| Totale volume | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| 10% APS | 139 ul | 125 ul | 67 pl | |
| TEMED | 14 pl | 12,5 ul | 6,7 pl |
Anode buffer: 25mm imidazol / HCl, pH 7,0
Kathode buffer: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0,05% w / v deoxycholaat, pH 7,0
Giet en uitvoeren gels in een koude kamer (4-7 ° C). De gebruikte aanvankelijke voltage is 100V. Wanneer het monster heeft de stacking gel ingevoerd, wordt de spanning verhoogd tot 500 V met de huidige beperkte tot 15 mA (voor 0.15 "14" 14-cm gels). Elektroforese is gestopt na 3-4 uur als de scherpe lijn van de rode kleurstof Ponceau S de gel front nadert. Als alternatief kan een gel 's nachts worden uitgevoerd met een constante spanning bij 70-100V.
- In-gel-activiteit assays. De tijd van incubatie voor elke assay afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten oplosbaar en de hoeveelheid van het materiaal geladen per putje. Complexen I, IV en V meestal opbrengst sterkere signalen dan de complexen II en III.
Complex I (CI)
Incubeer de gel plak met CI buffer (5mm Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH, 2.5mg/ml NBT) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CI buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4:
0.01g NADH
0,25 g NBT
Bevestig de gel in 50% methanol en 10% azijnzuur voor 15-45 minuten. De vaste gel wordt bewaard in 10% azijnzuur.
Complex II (CII)
Incubeer de gel plak met CII buffer (20mm natrium-succinaat, 0.2mm fenazine methasulfate; 2.5mg/ml NBT, 5mM Tris-HCl pH 7,4) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CII buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4:
200μl 1M natrium-succinaat
80μl fenazine methasulfate (250mm PMS opgelost in DMSO)
0,25 g NBT
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex III (CIII)
Incubeer de gel plak met CIII buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CIII buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex IV (CIV)
Incubeer de gel plak met CIV buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 50μM paard hart cytochroom c) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CIV buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
0.1g paard hart cytochroom c
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex V (CV)
Incubeer de gel plak met CV buffer (35mm Tris-base, 270mm glycine, pH 8,3 bij 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CV-buffer: Per 100 ml van de oplossing toe te voegen:
| Tris-base | 0.424g |
| Glycine | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Geen behoefte om pH (moet 8,3) aan te passen - gebruik geen zuur of base. Filter, en voeg
| ATP | 0.441g |
Bevestig de gel in 50% methanol gedurende 30 minuten en transfer naar het water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video, hebben we beschreven de extractie van de mitochondriale eiwitcomplexen uit menselijke embryonale stamcellen, hun scheiding door de hoge resolutie heldere inheemse gelelektroforese (hrCNE), en de daaropvolgende analyse door in-gel katalytische activiteit assays. hrCNE lost mitochondriale membraan eiwit complexen met een resolutie vergelijkbaar met die van autochtone blauwe gel elektroforese en is superieur voor in-gel-activiteit assays. Deze techniek kan niet alleen gebruikt ter mitochondriale ademhaling complexen IV te kwantificeren, maar ook om de subunit samenstelling van een mitochondriale membraan eiwit complex, zowel in hESC 's en in hun afgeleide nakomelingen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden momenteel ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken dr. Carla Koehler (UCLA) en leden van het Koehler laboratorium voor het verstrekken van advies en inzicht in deze en aanvullende studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
