Summary
इस वीडियो में, हम आपको बताएंगे कि कैसे मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों जेल गतिविधि assays में उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
Mitochondria cytoplasmic organelles कि सेलुलर चयापचय और homeostasis में एक प्राथमिक भूमिका है, सेल संकेतन नेटवर्क के विनियमन, और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु. Mitochondria उत्पादन एटीपी, cytoplasmic redox राज्य और सीए 2 + संतुलन को विनियमित, फैटी एसिड catabolize, heme, nucleotides, स्टेरॉयड हार्मोन, अमीनो एसिड synthesize, और प्रोटीन में लोहे सल्फर समूहों को इकट्ठा में मदद. Mitochondria भी गर्मी के उत्पादन में एक आवश्यक भूमिका है. Mitochondrial जीनोम के उत्परिवर्तन मानव विकार के कई प्रकार के कारण. mtDNA परिवर्तन के संचय उम्र बढ़ने के साथ संबद्ध है और कैंसर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका का संदेह है. सभी प्रकार की कोशिकाओं में उनके vitally महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, mitochondria के समारोह में भी स्टेम सेल के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए. प्रमुख अग्रिम स्टेम सेल व्यवहार्यता, प्रसार, और भेदभाव की क्षमता के बारे में हमारी समझ में बनाया गया है. लेकिन स्टेम कोशिकाओं के कार्यात्मक गतिविधि, विशेष रूप से अपनी ऊर्जा की स्थिति में, अभी तक नहीं विस्तार में था अध्ययन किया गया. लगभग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और उनके विभेदित अग्रदूत संतान के mitochondrial गुणों के बारे में कुछ नहीं जाना जाता है. एक को समझने और hESC समारोह और विकास क्षमता में mitochondria की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए सीधे mitochondrial श्वसन परिसरों के गतिविधि को मापने है. यहाँ, हम उच्च संकल्प स्पष्ट देशी जेल और जेल पांच hESCs की सांस श्रृंखला परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक विधि के रूप में गतिविधि के दृश्य में वैद्युतकणसंचलन बाद का वर्णन.
Protocol
Mitochondrial परिसर के लिए उच्च संकल्प साफ मूल निवासी जेल Electophoresis (hrCNE) में जेल गतिविधि Assays
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) ˠ विकिरणित या mitomycin सी का इलाज माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts, तो मानक स्थितियों का उपयोग MEF वातानुकूलित माध्यम में 5 दिनों के लिए Matrigel पर विकास करने के लिए स्विच की एक monolayer पर बनाए रखा गया. MEFs contaminating हटायें, hESCs थे Matrigel पर फिर से मढ़वाया और एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए MEF वातानुकूलित माध्यम में हो. Pluripotency Oct-4 और SSEA-4 मार्करों के लिए माइक्रोस्कोपी immunofluorescence hESC भेदभाव की कमी की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- 5 मिनट के लिए trypsinization (6 अच्छी तरह से एक थाली में 1ml 1x प्रति अच्छी तरह से trypsin) द्वारा पीछा गर्म 1x Pbs, 7.4 पीएच, के साथ कोशिकाओं धो लें.
- ताजा trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा (1x Pbs, 7.4 पीएच में 1mg/ml) जोड़ें. 200g पर हार्वेस्ट कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र, 5 मिनट, कमरे के तापमान.
- हौसले से तैयार 1 'protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ, 1.7ml (कक्ष गोली के आकार पर आधारित) - बर्फ के ठंडे mitochondria अलगाव बफर (6.6mM imidazole / एचसीएल, पीएच 7.0 83mM sucrose) के 0.8 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend pelleted कोशिकाओं त्यागें. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- एक homogenizer (- 50 स्ट्रोक ~ 40) के साथ कोशिकाओं Dounce. Trypan नीले रंग के साथ dounced कोशिकाओं के एक विभाज्य homogenization एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर की पूर्णता के लिए जाँच दाग.
- 20,000 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सी कच्चे mitochondrial गोली भी है कि नाभिक और बड़े सेल टुकड़े शामिल प्राप्त करने के लिए °. छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने और उपजी कच्चे mitochondrial गोली तौलना. गोली -80 पर संग्रहीत किया जा सकता ° सी तरल नाइट्रोजन में त्वरित ठंड के बाद अगर यह एक रोक बिंदु है.
नोट: विभेदकों centrifugation या अन्य ढाल आधारित प्रक्रियाओं एक शुद्ध mitochondrial झिल्ली अंश अलग और संग्रह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रेफरी देखें. विवरण के लिए 4. इस वैकल्पिक दृष्टिकोण mitochondrial के बजाय सेल वजन या सेल नंबर के प्रति मिलीग्राम जटिल गतिविधि प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम mitochondrial जटिल गतिविधि निकलेगा. शुद्धि के लिए यह तुलना करने के बाद निर्धारित किया mitochondrial प्रोटीन की एकाग्रता की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, एक अलग अलगाव बफर इस दृष्टिकोण के लिए आवश्यक हो सकता है. शुद्ध mitochondrial झिल्ली अंश के solubilization के लिए, नीचे कदम 6 के बाद नोट देखें. - बर्फ पर बर्फ ठंड solubilization बफर (NaCl 50mm, 50mm / imidazole एचसीएल पीएच 7.0, 1mm EDTA, 2mm 6 aminohexanoic एसिड) के साथ vortexing द्वारा कच्चे mitochondrial गोली solubilize. 6 aminohexanoic एसिड 1x Protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. गोली वजन के 20mg प्रति solubilization बफर के 35μl का प्रयोग करें. 10% w / v गोली वजन और ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण 20mg प्रति digitonin 20μl जोड़ें. बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं. Dodecyl BD-maltoside या Triton एक्स 100 digitonin के लिए एवजी किया जा सकता करने के लिए प्रोटीन solubilize. डिटर्जेंट और इसकी मात्रा की पसंद supercomplexes या mitochondrial परिसरों multimeric रूपों के गठन को प्रभावित कर सकता है. अधिक जानकारी के लिए, ref.1 देखें.
नोट: डिटर्जेंट की मात्रा के लिए एक शुद्ध mitochondrial झिल्ली अंश solubilize के लिए आवश्यक एक वजन / डिटर्जेंट प्रोटीन 2 - 6g / जी से लेकर अनुपात से मेल खाती है है इष्टतम mitochondrial झिल्ली solubilize अनुपात / dodecyl BD-maltoside के लिए 2.5g जी / 3 जी के लिए छ Triton एक्स-100, और 6g / digitonin के लिए जी. - 100.000 ग्राम में 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए solubilized गोली अपकेंद्रित्र स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
- अंतिम 5% w / ध् ग्लिसरॉल और 0.01% w / ध् काकरेज़ी रंग एस (50% ग्लिसरॉल w / ध् 0.1% w / v काकरेज़ी रंग एस लोड हो रहा है बफर स्टाक समाधान का उपयोग करें) करने के लिए बफर लोड हो रहा है जोड़ें.
- लोड एक मात्रा है कि 20-लेन प्रति कच्चे mitochondrial गोली के 40mg शामिल हैं के साथ जेल कुओं. एक 3.5% stacking जेल के साथ एक acrylamide ढाल जेल (4 -13%) का प्रयोग करें.
नोट: जेल की तैयारी और वैद्युतकणसंचलन शर्तों:
Acrylamide और bisacrylamide 1.5g (49.5% टी, 3% सी. कहाँ टी ए.ए. और bisAA और सी की कुल एकाग्रता की 48g जेल तैयारी के लिए, एक acrylamide / बीआईएस acrylamide (ए.ए. / bisAA) निम्नानुसार 3 मिश्रण का उपयोग करें: crosslinker (bisAA) के कुल monomer प्रतिशत).
जेल (3) बफर: 1.5M 6-aminohexanoic एसिड, 75mm imidazole, पीएच 7.0
ग्रेडियेंट जेल: | 4% | 13% | जेल Stacking: | 3.5% |
ए.ए. / bisAA 3 मिश्रण | 2 मिलीलीटर | 6.5 मिलीलीटर | 0.6 मिलीलीटर | |
जेल बफर 3 ' | 8.3 मिलीलीटर | 8.3 मिलीलीटर | 2.7 मिलीलीटर | |
ग्लिसरॉल | 5 छ | |||
एच 2 हे | 14.7 मिलीलीटर | 5 मिलीलीटर | 4.7 मिलीलीटर | |
कुल मात्रा | 25 मिलीलीटर | 25 मिलीलीटर | 8 मिलीलीटर | |
10% ए पी एस | 139 μl | 125 μl | 67 μl | |
TEMED | 14 μl | 12.5 μl | 6.7 μl |
Anode बफर: 25mm imidazole / एचसीएल, पीएच 7.0
कैथोड बफर: 50mm Tricine, 7.5mm imidazole / एचसीएल, 0.02% w / ध् dodecyl BD-maltoside, 0.05% w / ध् deoxycholate, पीएच 7.0
डालो और एक ठंडे कमरे (4-7 डिग्री सेल्सियस) में जैल चलाने. प्रारंभिक इस्तेमाल किया वोल्टेज 100V है. जब नमूना stacking जेल में प्रवेश किया है, वोल्टेज के साथ वर्तमान सीमित 15mA (0.15 '14' जैल 14 सेमी के लिए) 500V उठाया है. वैद्युतकणसंचलन 3-4 घंटे जब लाल एस काकरेज़ी रंग डाई के तेज लाइन जेल सामने दृष्टिकोण के बाद बंद कर दिया है. वैकल्पिक रूप से, एक जेल निरंतर वोल्टेज के साथ रात भर सकते हैं 70-100V पर चला.
- जेल में गतिविधि assays. प्रत्येक परख के लिए ऊष्मायन के समय प्रोटीन solubilization की दक्षता और सामग्री की मात्रा को अच्छी तरह से प्रति लोड पर निर्भर करता है. मैं, चतुर्थ और वी परिसर आमतौर पर परिसरों द्वितीय और तृतीय से मजबूत संकेतों उपज.
परिसर मैं (सीआई)
सीआई बफर (; 0.1mg/ml NADH 2.5mg/ml एनबीटी 5mm Tris - एचसीएल, 7.4 पीएच) के साथ कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए जेल टुकड़ा सेते हैं.
सीआई बफर: 5mm Tris - एचसीएल, पीएच 7.4 के 100ml प्रति जोड़ें:
0.01g NADH
0.25g एनबीटी
50% और 15-45 मिनट के लिए 10% एसिटिक एसिड मेथनॉल में जेल फिक्स. तय जेल 10% एसिटिक एसिड में संरक्षित है.
परिसर द्वितीय (सीआईआई)
सीआईआई बफर (; 0.2mm phenazine methasulfate; 2.5mg/ml एनबीटी 5mm Tris - एचसीएल 7.4 पीएच 20mm succinate सोडियम) के साथ कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए जेल टुकड़ा सेते हैं.
सीआईआई बफर: 5mm Tris - एचसीएल, पीएच 7.4 के 100ml प्रति जोड़ें:
200μl 1M सोडियम succinate
80μl phenazine methasulfate (250mm पीएमएस DMSO में भंग)
0.25g एनबीटी
के रूप में परिसर के लिए मैं जेल में वर्णित ठीक
परिसर क्ष्क्ष्क्ष् (CIII)
कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर, CIII बफर (0.05% 3,3 'diaminobenzidine (थपका) tetrahydrochloride 50mm सोडियम फास्फेट, 7.2 पीएच) के साथ जेल टुकड़ा सेते हैं.
CIII बफर: 50mm सोडियम फास्फेट, 7.2 पीएच के 100ml प्रति जोड़ें:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
के रूप में परिसर के लिए मैं जेल में वर्णित ठीक
परिसर चतुर्थ (CIV)
; CIV बफर (0.05% 3,3 tetrahydrochloride 'diaminobenzidine (थपका), 50μM घोड़े दिल साइटोक्रोम ग 50mm सोडियम फास्फेट, 7.2 पीएच) के साथ कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए जेल टुकड़ा सेते हैं.
CIV बफर: 50mm सोडियम फास्फेट, 7.2 पीएच के 100ml प्रति जोड़ें:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
0.1g घोड़े दिल साइटोक्रोम ग
के रूप में परिसर के लिए मैं जेल में वर्णित ठीक
परिसर वी (CV)
CV बफर (35 मिमी Tris आधार, 270mm ग्लाइसिन, 25 में पीएच 8.3 डिग्री सेल्सियस, 14mm MgSO 4, 0.2 w / v (3 सं) पंजाब 2, 8mm एटीपी%) कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए. के साथ जेल टुकड़ा सेते
CV बफर: समाधान के प्रति 100ml जोड़ें:
Tris - आधार | 0.424g |
Glycine | 2.026g |
4 MgSO | 0.345g |
पंजाब (3 सं) 2 | 0.29g |
नहीं (8.3 होना चाहिए) पीएच को समायोजित करने के लिए की जरूरत - एसिड या बेस प्रयोग नहीं करते. फ़िल्टर और जोड़ने
एटीपी | 0.441g |
ठीक 30 मिनट के लिए 50% मेथनॉल में जेल और पानी के लिए स्थानांतरण.
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Discussion
इस वीडियो में, हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, उच्च संकल्प स्पष्ट देशी जेल वैद्युतकणसंचलन (hrCNE) द्वारा उनकी जुदाई, और बाद में जेल उत्प्रेरक गतिविधि assays द्वारा विश्लेषण से mitochondrial प्रोटीन परिसरों की निकासी का वर्णन किया है. hrCNE हल करता है और एक नीले देशी जेल वैद्युतकणसंचलन के बराबर संकल्प पर mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसरों में जेल गतिविधि assays के लिए बेहतर है. यह तकनीक न केवल mitochondrial श्वसन परिसरों चतुर्थ मात्रा ठहराना करने के लिए, लेकिन यह भी दोनों hESCs में और उनके व्युत्पन्न संतान में किसी भी mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसर के सबयूनिट संरचना का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.
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Acknowledgments
Teitell प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल के अध्ययन वर्तमान में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) बीज अनुदान RS1 00,313 द्वारा समर्थित हैं. हम इन और अतिरिक्त अध्ययन में सलाह और अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए डा. कार्ला (UCLA) Koehler और Koehler प्रयोगशाला के सदस्यों धन्यवाद.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).