Summary
このビデオでは、我々は、ヒト胚性幹細胞のミトコンドリアの呼吸鎖複合体は、ゲルの活性アッセイに使用して分析できる方法を紹介します。
Abstract
ミトコンドリア細胞の代謝とホメオスタシス、細胞シグナル伝達ネットワークの制御、およびプログラム細胞死の主要な役割を持つ細胞質小器官です。ミトコンドリア農産物ATPは、細胞質酸化還元状態とCa2 +のバランスを調節脂肪酸を異化する、ヘム、ヌクレオチド、ステロイドホルモン、アミノ酸を合成し、タンパク質に鉄硫黄クラスターを組み立てるのに役立ちます。ミトコンドリアはまた、熱産生に不可欠な役割を持っている。ミトコンドリアゲノムの変異は、ヒトの疾患のいくつかのタイプを引き起こす。ミトコンドリアDNAの変異の蓄積は、老化や癌の発症において重要な役割を果たしていると疑われると相関する。すべての細胞型におけるそれらの極めて重要な役割のために、ミトコンドリアの機能はまた、幹細胞にとって重要でなければなりません。キーの進歩は、幹細胞の生存、増殖、及び分化能の我々の理解がなされている。しかし、幹細胞の機能活性は、特定の彼らのエネルギー状態で、まだ詳細に研究されていませんでした。ほとんど何もヒト胚性幹細胞（ヒトES）とそれらの差別化前駆体の子孫のミトコンドリアの性質については知られていない。ヒトES細胞の機能と発達の可能性のミトコンドリアの役割を理解し評価する一つの方法は、直接ミトコンドリアの呼吸器複合体の活性を測定することです。ここで、我々は、ヒトES細胞五呼吸鎖複合体を分析するための方法として、ゲルの活動の可視化で、高解像度明確なネイティブゲル電気泳動およびその後について説明します。
Protocol
ゲル内活性測定法ミトコンドリア複合体のための高解像度のクリア天然ゲルのElectophoresis（hrCNE）
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）は、標準的な条件を使用してMEF -馴化培地中で5日間マトリゲル上での成長に切り替えたˠ照射またはマイトマイシンC処理したマウス胚性繊維芽細胞（MEF）、の単層上で維持された。 MEFSを汚染除去するには、ヒトES細胞をマトリゲル上に再播種し、さらに3日間MEF -馴化培地中で増殖させた。多分化能マーカーOCT - 4およびSSEA - 4の免疫蛍光顕微鏡は、hESCの分化の欠如を確認するために使用されていました。
- 5分間トリプシン処理（6ウェルプレートにウェル当たり1 ×トリプシンを1ml）に続いて暖かい1 × PBS、pH7.4の、で細胞を洗浄する。
- 新鮮なトリプシンインヒビター（1X PBSで1mg/ml、pH7.4）を等量の。 200グラムで細胞を回収し、遠心分離、5分間、室温。
- 作りたての1'プロテアーゼインヒビターカクテルと、1.7ミリリットル（細胞ペレットのサイズに基づいて）氷冷ミトコンドリア分離バッファー（6.6mMイミダゾール/ HClを、pH 7.0の83mMスクロース）の - 0.8の上清と再懸ペレット化した細胞を捨てる。氷上で10分間インキュベートする。
- ホモジナイザー（ - 50ストローク〜40）で細胞をダウンス。光顕微鏡を用いて均質化の完全性をチェックするためにトリパンブルーでdounced細胞のアリコートを染色。
- 4℃で10分、20,000 gで遠心° Cにも核と大きな細胞断片が含まれている原油ミトコンドリアペレットを得た。デカントして上清を破棄し、析出した粗ミトコンドリアペレットの重量を量る。これは、停止点の場合、ペレットを液体窒素中で° C以下の瞬間冷凍-80℃で保存することができます。
注記：差動遠心分離または他の勾配に基づく手続きは純粋なミトコンドリア膜画分を分離して収集するために使用することができます。 refを参照してください。詳細については4。この代替アプローチは、ミトコンドリアタンパク質の代わりに細胞の重量または細胞数mg当たり複雑な活動のmg当たりミトコンドリア複合体の活性が得られます。ミトコンドリアタンパク質の濃度は、この比較を行うために精製した後に決定する必要があります。また、別の分離バッファは、このアプローチのために必要となる場合があります。純粋なミトコンドリア膜画分の可溶化のために、以下のステップ6次の注を参照してください。 - 氷冷可溶化バッファー（50mmのNaClを、50mmのイミダゾール/ HClでpHを7.0、1mMのEDTA、2mMの6 - アミノヘキサン酸）とボルテックスで氷の上で原油ミトコンドリアペレットを可溶化。 6 - アミノヘキサン酸は、1 ×プロテアーゼインヒビターカクテルに置き換えることができます。ペレットの重量の20mgのあたりの可溶化バッファーの35μlを使用してください。チューブをタッピングしペレットの重さとミックスの20mgを10％w / vのジギトニンの20μlのを追加。氷上で5〜10分間インキュベートする。ドデシル- BD -マルトシドまたはトリトンX - 100は、タンパク質を可溶化するためにジギトニンに置き換えることができます。洗剤とその量の選択は、supercomplexesまたはミトコンドリアの複合体の多量体の形態の形成に影響を与える可能性があります。詳細については、文献1を参照してください。
注：純粋なミトコンドリア膜画分を可溶化するために必要な洗剤の量は2〜6グラム/ gからまで洗剤/蛋白質の重量比に対応していますミトコンドリア膜を可溶化するための最適な比率は、ジギトニンのためのドデシル- BD -マルトシド、トリトンX - 100のための3G / gであり、6グラム/ gのG / 2.5グラムです。 - 4℃で15分間、100,000 gで可溶化したペレットを遠心透明な上清を集める。
- 最後の5％（w / v）のグリセロール、0.01％w / vのポンソーS（50％w / vのグリセロール、0.1％w / vのポンソーSローディングバッファーのストック溶液を使用）にローディングバッファーを追加します。
- レーンあたり原油ミトコンドリアペレットの20 - 40mgのを含むボリュームをゲルのウェルをロードする。 3.5パーセントスタッキングゲルとアクリルアミド勾配ゲル（4 -13％）を使用してください。
注：ゲルの調製と電気泳動条件：
ビスアクリルアミドのアクリルアミドと1.5グラム（49.5％T、TはAAとbisAAとCの合計濃度である3％Cはの48グラム：ゲルの調製のために、次のように、アクリルアミド/ビスアクリルアミド（AA / bisAA）3ミックスを使用してください全モノマーに対して架橋剤（bisAA）の割合）。
ゲルバッファー（3'）：1.5Mの6 - アミノヘキサン酸、75mmのイミダゾール、pH 7.0の
| 勾配ゲル： | 4パーセント | 13パーセント | ゲルをスタッキング： | 3.5パーセント |
| AA / bisAA 3ミックス | 2ミリリットル | 6.5ミリリットル | 0.6ミリリットル | |
| ゲルバッファー3' | 8.3ミリリットル | 8.3ミリリットル | 2.7ミリリットル | |
| グリセロール | 5グラム | |||
| H 2 O | 14.7ミリリットル | 5ミリリットル | 4.7ミリリットル | |
| 合計ボリューム | 25ミリリットル | 25ミリリットル | 8ミリリットル | |
| 10％のAPS | 139μL | 125μlの | 67μlの | |
| TEMED | 14μL | 12.5μL | 6.7μL |
陽極バッファー：25mMのイミダゾール/ HClを、pH 7.0の
陰極バッファー：50mmのトリシン、7.5mmのイミダゾール/ HClを、0.02％（w / v）のドデシル- BD -マルトシド、0.05％（w / v）のデオキシコール酸、pH 7.0の
寒い部屋（4-7℃）でゲルを注ぎ、実行する。使用する初期電圧は100Vです。サンプルがスタッキングゲルを入力したとき、電圧は15mA（0.15'14'14 cmのゲル用）に電流に制限を500Vに上げている。赤色のポンソーS染色のシャープなラインがゲルの正面に近づくと電気泳動は3〜4時間後に停止されます。また、ゲルを70 - 100Vの定電圧で一晩実行することができます。
- ゲル内の活性をアッセイ。各アッセイのインキュベーションの時間は、タンパク質の可溶化の効率性とウェルあたりにロードされる材料の量に依存します。複合体I、IVおよびVは、通常、複合体IIおよびIIIよりも強いシグナルが得られる。
複雑なI（CI）
数時間室温でCIバッファー（2.5mg/ml NBT; 0.1mg/ml NADH 5mMのトリス- HCl、pH7.4）でゲルスライスをインキュベートする。
CIバッファ：5mMのトリス- HCl、pH7.4の100mlあたり追加：
0.01グラムNADH
0.25グラムNBT
15〜45分間50％メタノールと10％酢酸でゲルを修正。固定ゲルを10％酢酸に保存されています。
複合体II（CII）
数時間室温でCIIバッファー（5mMのトリス- HCl pH7.4の、0.2mmのフェナジンのmethasulfate; 2.5mg/ml NBTコハク酸20mMの炭酸ナトリウム）でゲルスライスをインキュベートする。
CIIバッファ：5mMのトリス- HCl、pH7.4の100mlあたり追加：
200μlの1Mコハク酸ナトリウム
80μlフェナジンのmethasulfate（250mmのPMSはDMSOに溶解）
0.25グラムNBT
私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正
複雑なIII（CIII）
室温で数時間のため、CIIIバッファー（0.05％の3,3' - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）50mmのリン酸ナトリウム、pH7.2）でゲルスライスをインキュベートする。
CIIIバッファ：50mmのナトリウム - リン酸、pHが7.2の100mlあたり追加：
50mgのジアミノベンジジン四塩酸塩
私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正
複雑なIV（CIV）
数時間室温で、CIVバッファー（0.05％の3,3' - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）、50μMウマ心臓シトクロムc 50mmのリン酸ナトリウム、pH7.2）でゲルスライスをインキュベートする。
CIVバッファ：50mmのナトリウム - リン酸、pHが7.2の100mlあたり追加：
50mgのジアミノベンジジン四塩酸塩
0.1グラムウマ心臓シトクロムc
私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正
複雑なV（CV）
CVバッファ室温（35トリス塩基、税込グリシン、25℃でpHが8.3 ° C、14mmのMgSO 4を 、0.2％w / vの鉛（NO 3）2、8MM ATP）数時間でゲルスライスをインキュベートする。
CVバッファ：ソリューションのあたり100ミリリットルを追加：
| トリス塩基 | 0.424グラム |
| グリシン | 2.026グラム |
| MgSO 4を | 0.345グラム |
| 鉛（NO 3）2 | 0.29グラム |
（8.3でなければなりません）、pHを調整する必要はありません - 酸または塩基を使用しないでください。フィルタリングと追加
| ATP | 0.441グラム |
30分間50％メタノールでゲルを修正し、水に移す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このビデオでは、我々は、ヒト胚性幹細胞、高解像度の明確なネイティブゲル電気泳動（hrCNE）によるそれらの分離、およびゲル内触媒活性のアッセイによって、その後の解析からミトコンドリアタンパク質複合体の抽出を説明してきました。 hrCNEはブルーネイティブゲル電気泳動に匹敵する解像度でミトコンドリアの膜タンパク質複合体を解決し、ゲル内活性アッセイ用に優れています。この手法は、ミトコンドリアの呼吸器複合体IVを定量化するだけでなく、ヒトES細胞およびその派生子孫の両方の任意のミトコンドリア膜タンパク質複合体のサブユニットの組成を分析するだけでなく、使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitellラボでヒト胚性幹細胞の研究は現在、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 - 00313でサポートされています。我々は、これらおよびその他の研究でアドバイスや洞察を提供するための博士カルラケーラー（UCLA）とケーラー研究室のメンバーに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
