Summary
Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.
Abstract
Mitokondri, sitoplazma, hücre metabolizması ve homeostasis birincil rolü var organelleri, hücre sinyal ağının düzenlenmesi, ve programlı hücre ölümü. Mitokondri üretmek ATP, sitoplazmik redoks devlet ve Ca2 + dengesini düzenleyen yağ asitleri catabolize, hem, nükleotidler, steroid hormonlar, amino asitler, sentez ve proteinlerin demir-kükürt kümeleri bir araya yardımcı. Mitokondri, aynı zamanda ısı üretimi önemli bir rolü var. Mitokondriyal genom mutasyonları insan bozukluğunun çeşitli neden olur. MtDNA mutasyonlarının birikmesi, yaşlanma ile ilişkilidir ve kanser gelişiminde önemli bir role sahip şüphelenilen. Tüm hücre tipleri hayati önemli rol nedeniyle, mitokondri fonksiyonu da kök hücreler için kritik öneme sahip olmalıdır. Kök hücre canlılığı, proliferasyon ve farklılaşma kapasitesi anlayışımızın önemli ilerlemeler yapılmıştır. Ancak kök hücrelerin fonksiyonel aktivite, özellikle enerji durumu, henüz detaylı bir şekilde incelenmemiştir değildi. Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve farklılaştırılmış habercisi döl mitokondriyal özellikleri hakkında neredeyse hiçbir şey bilinir. HESC işlev ve gelişim potansiyeli mitokondri rolünü anlamak ve değerlendirmek için tek yolu doğrudan mitokondriyal solunum kompleksleri aktivitesini ölçmek için. Burada, yüksek çözünürlüklü hESC beş solunum zinciri kompleksleri analiz etmek için bir yöntem olarak jel faaliyet görselleştirme net yerli jel elektroforezi ve sonraki açıklar.
Protocol
Mitokondrial Kompleksi için Yüksek Çözünürlüklü Temizle Doğal Jel Electophoresis (hrCNE)-Gel Aktivitesi Tahliller
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) standart koşullar kullanarak MEF-klimalı ortamda 5 gün sonra Matrigel büyüme geçiş ˠ ışınlanmış veya mitomisin C ile tedavi edilen fare embriyonik fibroblastlar (MEFS), bir tek tabaka üzerinde tutuldu. MEFS kirlenmesine neden kaldırmak için, hESC Matrigel yeniden kaplama ve ek olarak 3 gün boyunca MEF-klimalı ortamda yetişen. Pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 İmmünofloresan mikroskopi hESC farklılaşma olmaması onaylamak için kullanılır oldu.
- , 5 dakika boyunca trypsinization (6 plaka kişi başına 1ml 1x tripsin) takip ılık 1x PBS, pH 7.4, hücreleri yıkayın.
- Taze tripsin inhibitörü eşit hacmi (1x PBS, pH 7.4 1mg/ml) ekleyin. Hasat hücreleri ve 200g az santrifüj, 5 dakika, oda sıcaklığında.
- Taze hazırlanmış 1 'Proteaz İnhibitör Kokteyl; 1.7ml (hücre pelet boyutu dayalı), buz gibi mitokondri izolasyon tamponu (6.6mM imidazol / HCl, pH 7.0 83mm sakkaroz) - 0.8 supernatant ve tekrar süspansiyon pelet hücreleri atın. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Homojenizatör (- 50 vuruş ~ 40) ile hücreler Dounce. Tripan mavisi ile dounced hücrelerinin ışık mikroskobu kullanılarak homojenizasyon tamlığı kontrol etmek için bir kısım Leke.
- 4 10 dakika 20.000 g Santrifüj ° C çekirdek ve daha büyük hücre parçaları da içeren bir ham mitokondriyal pelet elde etmek için. Durusu ve süpernatantı atmak ve çöktürülmüş ham mitokondriyal pelet tartmak. Pelet -80 saklanabilir ° Bu bir durak noktası ise C sıvı azot anlık dondurma.
NOT: Diferansiyel santrifüj veya diğer gradyan tabanlı işlemleri saf mitokondriyal membran fraksiyonu yalıtma ve toplamak için kullanılabilir. Bkz. Ürün. 4 Ayrıntılı bilgi için. Bu alternatif bir yaklaşım yerine hücre ağırlığı veya hücre sayısını mg başına karmaşık aktivite mitokondriyal protein mg başına mitokondriyal karmaşık aktivite verecektir. Mitokondriyal proteinlerin konsantrasyonu, bu karşılaştırma yapmak için arıtma sonra tespit edilmesi gerekecektir. Ayrıca bu yaklaşım, farklı bir izolasyon tampon için gerekli olabilir. Saf mitokondriyal membran fraksiyonu çözünürleştirme için, adım 6'da aşağıdaki nota bakınız. - Buz üzerinde buz çözünürleştirme tamponu (50mm NaCl, 50mm imidazol / HCl pH 7,0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic asit) ile vorteks ham mitokondriyal pelet çözünür. 6-aminohexanoic asit 1x Proteaz İnhibitör Kokteyl ile değiştirilebilir. 35μl pelet ağırlığı 20 mg başına çözünürleştirme tampon kullanın. % 10 w / v digitonin pelet ağırlığı ve tüp hafifçe vurarak karıştırın 20mg başına 20μl ekleyin. Buz üzerinde 5-10 dakika inkübe. Dodesil-BD-maltoside veya triton X-100 proteinleri çözünür digitonin ikame edilebilir. Deterjan ve miktarı seçim supercomplexes veya mitokondriyal komplekslerinin multimer formları oluşumunu etkileyebilir. Daha fazla bilgi için, ref.1 bkz.
NOT: saf mitokondriyal membran fraksiyonu çözünür için gerekli deterjan miktarı, 2-6g / g arasında değişen bir deterjan / protein ağırlık oranına karşılık Mitokondrial membranlar çözünür optimal oranı dodesil-BD-maltoside g / 2.5g için 3g / g triton X-100 ve 6g / digitonin g. - 15 dakika 4 ° C 100.000 g çözündüğünü pelet Santrifüj Net süpernatant toplayın.
- Son% 5 w / v gliserol ve% 0.01 w / v Ponceau S (% 50 w / v gliserol,% 0.1 w / v Ponceau S yükleme tamponu stok solüsyonu kullanmak) tampon yükleme ekleyin.
- 20-40mg şeritli başına ham mitokondriyal pelet içeren bir hacmi ile jel kuyu yükleyin. % 3.5 jel istifleme ile bir akrilamid gradyan jel (4 -13%) kullanın.
NOT: Jel hazırlanması ve elektroforez koşulları:
Bisacrylamide akrilamid ve 1.5g (% 49.5 T, T, AA ve bisAA ve C toplam konsantrasyonu% 3 C 48g: jel hazırlanması için, aşağıdaki gibi bir akrilamid / bis-akrilamid (AA / bisAA) 3 karışımı kullanın toplam monomer, çapraz bağlayıcı (bisAA) yüzde olarak).
Jel tampon (3): 1.5M 6-aminohexanoic asit; 75mm imidazol, pH 7.0
| Gradient jel: | % 4 | % 13 | Jel İstifleme: | % 3.5 |
| AA / bisAA 3 karışımı | 2 ml | 6,5 ml | 0,6 ml | |
| Jel tampon 3 ' | 8.3 ml | 8.3 ml | 2.7 ml | |
| Gliserin | 5 g | |||
| H 2 O | 14.7 ml | 5 ml | 4.7 ml | |
| Toplam hacim | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| 10% APS | 139 ul | 125 ul | 67 ul | |
| TEMED | 14 ul | 12.5 ul | 6.7 ul |
Anot tampon: 25mm imidazol / HCl, pH 7.0
Katot tamponu: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl,% 0,02 w / v dodesil-BD-maltoside,% 0.05, pH 7.0 w / v deoksikolatın
Dökün ve soğuk bir oda (4-7 ° C) jeller çalıştırmak. Kullanılan ilk gerilimi 100V. Örnek istifleme jel girdiğinde, voltaj 15mA (0.15 '14' 14 cm jeller), akım sınırlı 500V yükseltilir. Elektroforez keskin bir çizgi, kırmızı Ponceau S boya jel ön yaklaşımlar 3-4 saat sonra durdurulur. Alternatif olarak, bir jel 70-100V sabit gerilim ile gece çalıştırmak olabilir.
- Jel aktivite testleri. Protein çözünmüş verimlilik ve iyi ortalama yüklenen malzeme miktarı her bir deney için inkübasyon süresi bağlıdır. I, IV ve V kompleksler genellikle kompleksleri II ve III daha güçlü sinyaller verir.
Kompleks I (CI)
Birkaç saat oda sıcaklığında jel dilim CI tamponu (2.5mg/ml NBT; 0.1mg/ml NADH 5mM Tris-HCl, pH 7.4) ile inkübe edin.
CI tamponu: 5mM Tris-HCl, pH 7.4 100ml başına ekleyin:
0.01g NADH
0.25g NBT
15-45 dakika için% 50 metanol ve% 10 asetik asit jel sabitleyin. Sabit% 10 asetik asit jel korunur.
Kompleks II (CII)
CII tampon (0.2mm phenazine methasulfate;; 5mM Tris-HCl pH: 7.4; 2.5mg/ml NBT süksinat 20mm sodyum) ile oda sıcaklığında birkaç saat için jel dilim inkübe edin.
CII tamponu: 5mM Tris-HCl, pH 7.4 100ml başına ekleyin:
200μl 1M sodyum süksinat
80μl phenazine methasulfate (250mm PMS DMSO içinde çözünmüş)
0.25g NBT
Fix gibi Kompleksi için jel
Kompleks III (CIII)
, Oda sıcaklığında birkaç saat için; CIII tamponu (0.05% 3,3 '-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB), 50mm sodyum fosfat, pH 7.2) ile jel dilim inkübe edin.
CIII tampon: 50mm sodyum-fosfat, pH 7,2 100ml başına ekleyin:
50mg diaminobenzidin tetrahydrochloride
Fix gibi Kompleksi için jel
Kompleks IV (CIV)
Birkaç saat süreyle oda sıcaklığında; CIV tampon (0.05% 3,3 '-diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB), 50μM at kalp sitokrom c 50mm sodyum fosfat, pH 7.2) ile jel dilim inkübe edin.
CIV tampon: 50mm sodyum-fosfat, pH 7,2 100ml başına ekleyin:
50mg diaminobenzidin tetrahydrochloride
0.1g at kalp sitokrom c
Fix gibi Kompleksi için jel
Karmaşık V (CV)
Jel dilim CV tampon (35mm Tris-taban, 270mm glisin pH 8.3, 25 ° C, 14mm MgSO 4,% 0.2 w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) birkaç saat oda sıcaklığında inkübe
CV tampon başına çözüm 100ml eklemek:
| Tris-baz | 0.424g |
| Glisin | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
PH (8.3 olmalıdır) ayarlamak gerek yok - asit veya baz kullanmayın. Filtre ve ekle
| ATP | 0.441g |
30 dakika süreyle% 50 metanol Fix jel ve su aktarmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video, insan embriyonik kök hücreleri, yüksek çözünürlükte net yerli jel elektroforezi (hrCNE) ayrılması, ve jel katalitik etkinlik analizleri ile sonraki analiz mitokondriyal protein kompleksleri çıkarma tarif ettiler. hrCNE mavi yerel jel elektroforezi ile karşılaştırılabilir bir çözünürlükte mitokondrial membran protein kompleksleri giderir ve jel faaliyet deneyleri için üstündür. Bu teknik, mitokondriyal solunum kompleksleri IV ölçmek için değil, aynı zamanda hESC ve bunların türev döl hem de herhangi bir mitokondrial membran protein kompleksi altbirim kompozisyon analiz etmek değil sadece istihdam edilebilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitell laboratuvar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları henüz California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Biz bu ve ek çalışmalar tavsiye ve anlayışlar sağlamak için Dr. Carla Köhler (UCLA) ve Köhler, laboratuvar üyelerine teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
