Summary
I den här videon kommer vi att visa dig hur det mitokondriella andningskedjan komplex av mänskliga embryonala stamceller kan analyseras med hjälp av analyser gel aktivitet.
Abstract
Mitokondrierna är cytoplasmiska organeller som har en central roll i cellulär metabolism och homeostas, reglering av cellsignalering nätverket och programmerad celldöd. Mitokondrier producerar ATP, reglera cytoplasmisk redox staten och Ca2 + balans, katabolisera fettsyror, syntetisera heme, nukleotider, steroidhormoner, aminosyror, och hjälpa montera järn-svavel-kluster i proteiner. Mitokondrierna har också en viktig roll i värmeproduktionen. Mutationer av mitokondriella genomet orsaka flera typer av mänsklig störning. Ansamling av mtDNA mutationer korrelerar med åldrande och misstänks ha en viktig roll i utvecklingen av cancer. På grund av sin mycket viktig roll i alla typer av celler måste mitokondriernas funktion också vara avgörande för stamceller. Viktiga framsteg har gjorts i vår förståelse av stamceller livskraft, tillväxt och differentiering kapacitet. Men den funktionella aktiviteten av stamceller, i synnerhet deras energi status, inte var ännu inte studerats i detalj. Nästan ingenting är känt om mitokondriella egenskaper av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och deras differentierade föregångare avkomma. Ett sätt att förstå och värdera betydelsen av mitokondrier i hESC funktion och utvecklingspotential är att direkt mäta aktiviteten av mitokondriell andningsorganen komplex. Här beskriver vi hög upplösning tydliga infödda gelelektrofores och efterföljande i gel aktivitet visualisering som en metod för att analysera de fem andningskedjan komplex av hESCs.
Protocol
Hög upplösning Clear Native Gel Electophoresis (hrCNE) för mitokondriernas Complex In-Gel aktivitet analyser
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) bibehölls på en monolager av ˠ-bestrålat eller mitomycin C-behandlade möss embryonala fibroblaster (MEFs), sedan bytte till tillväxt på Matrigel under 5 dagar i MEF-conditioned medel med hjälp av vanliga förhållanden. För att ta bort kontaminerande MEFs var hESCs nytt pläterade på Matrigel och odlas i MEF-conditioned medium för ytterligare 3 dagar. Immunofluorescensmikroskopi för pluripotens markörer oktober-4 och SSEA-4 har använts för att bekräfta bristen på hESC differentiering.
- Tvätta cellerna med varma 1x PBS, pH 7,4, följt av trypsinization (1 ml 1x trypsin per brunn i en 6-brunnar) i 5 minuter.
- Tillsätt en motsvarande volym av färska trypsininhibitorerna (1mg/ml i 1x PBS, pH 7,4). Harvest celler och centrifugera vid 200 g, 5 min, rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleterat celler i 0,8 - 1,7 ml (baserat på storleken på cellpelleten) av iskall mitokondrier isolering buffert (83mm sackaros, 6.6mm imidazol / HCl, pH 7,0) med nylagade 1 "proteashämmare Cocktail. Inkubera på is i 10 min.
- Dounce celler med en homogeniseringsblandare (~ 40 till 50 slag). Fläck en delmängd av dounced celler med trypan blå för att kontrollera om fullständig homogenisering med hjälp av ett ljusmikroskop.
- Centrifugera vid 20 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C för att få en grov mitokondrie-pellets som också innehåller kärnor och större fragment cell. Dekantera och kassera supernatanten och väger utfällda råa mitokondriella pellets. Den pellets kan förvaras vid -80 ° C efter omedelbar frysning i flytande kväve om det är ett stopp punkt.
OBS: Differential centrifugering eller andra gradient-baserade förfaranden kan användas för att isolera och samla en ren mitokondriemembranet bråk. Se ref. 4 för mer information. Denna alternativa metod kommer att ge den mitokondriella komplex aktivitet per mg av mitokondrie-protein istället för komplex aktivitet per mg cell vikt eller mobilnummer. Koncentrationen av mitokondriella proteiner måste bestämmas efter rening att göra denna jämförelse. Dessutom får en annan isolering buffert krävas för denna strategi. För lösningsgörande av rena mitokondriemembranet fraktion, se not följande steg 6 nedan. - Löses den råa mitokondriella pelleten på isen genom att vortexa med iskallt lösningsgörande buffert (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1mm EDTA, 2 mm 6-aminohexanoic syra). 6-aminohexanoic syra kan ersättas med 1x Proteashämmare Cocktail. Användning 35μl av lösningsgörande buffert per 20mg av pellets vikt. Tillsätt 20μl på 10% w / v digitonin per 20mg av pellets vikt och blanda genom att ställa röret. Inkubera i 5-10 minuter på is. Dodecyl-BD-maltoside eller Triton X-100 kan ersätta digitonin att löses proteinerna. Valet av tvättmedel och kvantiteten kan påverka bildningen av supercomplexes eller multimeric former av mitokondriell komplex. För mer information, se ref.1.
OBS: Mängden diskmedel som krävs för att löses en ren mitokondriemembranet fraktionen motsvarar en tvätt / protein vikt allt från 2-6g / g. Det optimala förhållandet att löses mitokondriernas membran är 2.5G / g för dodecyl-BD-maltoside, 3g / g för Triton X-100, och 6g / g för digitonin. - Centrifugera solubilized pellets på 100 tusen gi 15 minuter vid 4 ° C. Samla klar supernatant.
- Lägg buffert till en slutlig 5% w / v glycerol och 0,01% w / v Ponceau S (använd en 50% w / v glycerol, 0,1% w / v Ponceau S buffert stamlösning).
- Ladda gel brunnar med en volym som innehåller 20-40mg av den råa mitokondriella pellets per bana. Använd en gel akrylamid gradient (4 -13%) med 3,5% stapling gel.
OBS: Gel förberedelse och villkor elektrofores:
För gel beredning, använd en akrylamid / BIS-akrylamid (AA / bisAA) 3 mix enligt följande: 48g av akrylamid och 1,5 g bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Om T är totala koncentrationen av AA och bisAA och C är andelen crosslinker (bisAA) till totalt monomer).
Gel buffert (3): 1,5 m 6-aminohexanoic syra, 75mm imidazol, pH 7,0
| Gradient gel: | 4% | 13% | Stapling gel: | 3,5% |
| AA / bisAA 3 mix | 2 ml | 6,5 ml | 0,6 ml | |
| Gel buffert 3 " | 8,3 ml | 8,3 ml | 2,7 ml | |
| Glycerol | 5 g | |||
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | 4,7 ml | |
| Total volym | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| 10% APS | 139 l | 125 l | 67 l | |
| TEMED | 14 l | 12,5 l | 6,7 l |
Anod buffert: 25mm imidazol / HCl, pH 7,0
Cathode buffert: 50 mM Tricine, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0,05% w / v ingår i detta vaccin, pH 7,0
Häll och köra geler i ett kylrum (4-7 ° C). Den initiala spänning som används är 100V. När provet har kommit in i stapling gel, är spänningen höjs till 500V med nuvarande begränsade till 15mA (för 0,15 "14" 14-cm geler). Elektrofores stoppas efter 3-4 tim när skarp linje av röda Ponceau S färgämnet närmar gelen fronten. Alternativt kan en gel köras över en natt med konstant spänning på 70-100V.
- I-gel aktivitet analyser. Tiden för inkubationstiden för varje analys beroende av hur effektivt av protein lösningsgörande och mängden material som laddats per brunn. Komplex I, IV och V ger vanligen starkare signaler än komplex II och III.
Komplex I (CI)
Inkubera gelen skiva med CI buffert (5mm Tris-HCl, pH 7,4, 0.1mg/ml NADH, 2.5mg/ml NBT) i rumstemperatur i flera timmar.
CI buffert: Lägg per 100 ml 5mm Tris-HCl, pH 7,4:
0,01 g NADH
0.25g NBT
Fäst gel i 50% metanol och 10% ättiksyra för 15-45 min. Den fasta gelen är bevarad i 10% ättiksyra.
Komplexa II (CII)
Inkubera gelen skiva med CII buffert (20mm natrium succinat; 0.2mm phenazine methasulfate, 2.5mg/ml NBT, 5mm Tris-HCl pH 7,4) i rumstemperatur i flera timmar.
CII buffert: Lägg per 100 ml 5mm Tris-HCl, pH 7,4:
200μl 1M natrium succinat
80μl phenazine methasulfate (250mm PMS löst i DMSO)
0.25g NBT
Fäst gel som beskrivs för Complex I
Komplexa III (CIII)
Inkubera gelen skiva med CIII buffert (50 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-Diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB)) i rumstemperatur i flera timmar.
CIII buffert: Tillsätt 100 ml 50 mM natrium-fosfat, pH 7,2:
50mg Diaminobenzidin tetrahydrochloride
Fäst gel som beskrivs för Complex I
Komplex IV (CIV)
Inkubera gelen skiva med CIV buffert (50 mM natriumfosfat, pH 7,2, 0,05% 3,3 '-Diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB), 50μM häst hjärtat cytokrom c) i rumstemperatur i flera timmar.
CIV buffert: Tillsätt 100 ml 50 mM natrium-fosfat, pH 7,2:
50mg Diaminobenzidin tetrahydrochloride
0.1g häst hjärta cytokrom c
Fäst gel som beskrivs för Complex I
Komplex V (CV)
Inkubera gelen skiva med CV buffert (35mm Tris-bas, 270mm glycin, pH 8,3 vid 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8 mm ATP) i rumstemperatur i flera timmar.
CV buffert: Per 100ml lösning tillägga:
| Tris-bas | 0.424g |
| Glycine | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Inget behov av att justera pH (ska vara 8,3) - Använd inte syra eller bas. Filter och lägga
| ATP | 0.441g |
Fäst gel i 50% metanol i 30 min och överför till vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video har vi beskrivit utvinning av mitokondriella proteinkomplex från mänskliga embryonala stamceller, deras separation med hög upplösning tydliga infödda gelelektrofores (hrCNE) och den efterföljande analysen av i-gel katalytisk aktivitet analyser. hrCNE löser mitokondriella komplex membranprotein med en upplösning jämförbar med blå infödda gelelektrofores och är överlägsen i-gel aktivitet analyser. Denna teknik kan användas inte bara för att kvantifiera mitokondrie andningsorganen komplex IV, men också att analysera subenheten sammansättningen på något mitokondriemembranbarriären proteinkomplex både i hESCs och i deras derivat avkomma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds för närvarande av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar Dr Carla Koehler (UCLA) och medlemmar av Koehler laboratorium för att ge råd och insikt i dessa och ytterligare studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
