Summary
在这段视频中，我们将向您可以分析人类胚胎干细胞的线粒体呼吸链复合物如何使用凝胶活性测定。
Abstract
线粒体是细胞质的细胞器，有一个细胞代谢和动态平衡的主要作用，细胞信号转导网络调控，和程序性细胞死亡。线粒体产生ATP，调节细胞质的氧化还原状态和Ca2 +的平衡，分解代谢脂肪酸，合成血红素，核苷酸，类固醇激素，氨基酸，并帮助组装蛋白的铁硫簇。线粒体也有产热的重要作用。线粒体基因组的突变引起人类疾病的几种类型。 mtDNA突变的积累与衰老相关，怀疑是在癌症发展的重要作用。由于他们的作用极为重要，在所有类型的细胞，线粒体的功能，还必须干细胞的关键。干细胞活力，增殖和分化能力的认识已经取得了重要进展。但干细胞的功能活动，尤其是他们的能量状态，尚未被详细研究。几乎没有什么是已知的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），和他们的区别的易制毒化学后代线粒体属性。线粒体在人类胚胎干细胞的功能和发展潜力作用来认识和评价的方法之一是直接测定线粒体呼吸复合物的活性。在这里，我们描述了高分辨率的清晰的原生凝胶电泳凝胶作为活动的可视化分析五年的人类胚胎干细胞呼吸链复合物的方法和后续。
Protocol
高分辨率清除母语凝胶Electophoresis线粒体复合物（hrCNE）活性测定 - 凝胶
单层ˠ照射或丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）然后切换MEF空调介质中，使用标准的条件下5天的基质胶上的增长，对维持人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）。为了去除污染MEFs，人类胚胎干细胞被重新镀上基质胶和MEF空调额外3天的中期增长。 Oct - 4和SSEA - 4的多能性标志物免疫荧光显微镜是用来确认的人类胚胎干细胞分化的缺乏。
- 细胞与温暖的1X PBS，pH值7.4，胰蛋白酶（1毫升1X胰蛋白酶在6孔板，每孔）5分钟洗净。
- 添加新鲜的胰蛋白酶抑制剂等体积（1mg/ml的1X PBS，pH值7.4）。在200克收获细胞和离心5分钟，室温。
- 丢弃在0.8上清液和悬浮颗粒细胞 - 1.7毫升冰冷的线粒体隔离缓冲区（83MM蔗糖; 6.6mM咪唑/盐酸，pH值7.0）（根据细胞沉淀的大小）新鲜配制的1蛋白酶抑制剂。在冰上孵育10分钟。
- Dounce细胞与均质机（〜40 - 50杆）。 dounced细胞台盼蓝染色等份，以同质化的使用光学显微镜的完整性检查。
- 在20000克离心10分钟，4 ° C至获得原油线粒体还包含细胞核和细胞碎片较大的颗粒。倒出并丢弃上清液，并权衡沉淀原油线粒体颗粒。颗粒可以保存于-80 ° C以下液氮的瞬间凝固，如果这是一个停止点。
注：可以用于分离和收集一个纯粹的线粒体膜分数差速离心或其他基于梯度程序。见文献。有关详细信息，4。这种替代的方法将产生每毫克线粒体蛋白复杂的活动，而不是每毫克体重细胞或细胞数量的线粒体复杂的活动。线粒体蛋白的浓度，将需要净化，使这个比较后确定。此外，这种方法可能需要不同的隔离缓冲。溶解纯线粒体膜分数，请注意以下步骤6。 - 冰冰冷的增溶缓冲液（氯化钠50MM，50MM咪唑/盐酸pH值7.0，为1mM EDTA，2MM 6 - 氨基己酸）涡旋溶解原油线粒体颗粒。 6 - 氨基己酸，可以被替换为1个蛋白酶抑制剂。使用颗粒重量的20毫克每增溶缓冲液35μl。加入20μL的10％W / V每20毫克的颗粒重量和组合由轻弹管毛地黄皂苷。在冰上孵育5-10分钟。十二烷基- BD -麦芽糖或Triton X - 100可替代毛地黄皂苷溶解的蛋白质。洗涤剂和数量的选择可能会影响supercomplexes线粒体复合物多聚体形式的形成。欲了解更多信息，请参阅参考资料1。
注：所需数量的洗涤剂溶解一个纯粹的线粒体膜分数对应的洗涤剂/蛋白质2 - 6G /克不等的重量比。溶解线粒体膜的最佳比例是2.5克/克为十二烷基- BD -麦芽糖，3G / G为Triton X - 100，和6g /毛地黄皂苷克。 - 10万克离心15分钟在4 ° C溶解的沉淀收集上清液。
- 样缓冲液加入到最后的5％W / V甘油和0.01％W / V丽春红（使用50％W / V甘油，0.1％W / V丽春红加载缓冲库存解决方案）。
- 装载卷包含原油线粒体颗粒每通道20 - 40毫克凝胶井。使用3.5％的浓缩胶，丙烯酰胺梯度凝胶电泳（4 -13％）。
注：凝胶的制备及电泳条件：
凝胶法制备，使用如下的丙烯酰胺/双丙烯酰胺（AA / bisAA）3组合：丙烯酰胺和双丙烯酰胺1.5克（49.5％T，3％，其中T是AA和bisAA和C总浓度是48克总单体交联剂（bisAA）的百分比）。
胶缓冲液（3）：1.5M 6 - 氨基己酸; 75MM咪唑，pH值7.0
| 梯度凝胶： | 4％ | 13％ | 浓缩胶： | 3.5％ |
| AA / bisAA 3混合 | 2毫升 | 6.5毫升 | 0.6毫升 | |
| 凝胶缓冲3“ | 8.3毫升 | 8.3毫升 | 2.7毫升 | |
| 甘油 | 5克 | |||
| H 2 O | 14.7毫升 | 5毫升 | 4.7毫升 | |
| 总成交量 | 25毫升 | 25毫升 | 8毫升 | |
| 10％的APS | 139μL | 125μL | 67μL | |
| TEMED | 14μL | 12.5μL | 6.7μL |
阳极缓冲：25MM咪唑/盐酸，pH值7.0
阴极缓冲液：50MM，7.5MM咪唑甘氨酸/盐酸，0.02％W / V十二烷基- BD -麦芽糖，0.05％，pH值7.0 W / V脱氧胆酸
在寒冷的房间（4-7℃）倒入和运行凝胶。所使用的初始电压是100V。当样品进入浓缩胶，引发电压与电流限制到500V至15mA（0.15'14“14厘米凝胶）。电泳后3-4小时，当红色的丽春红染料的急剧行的方法凝胶前停止。另外，凝胶可以用恒压运行在70 - 100V过夜。
- 凝胶活性测定。每次检测的孵化时间取决于蛋白质增溶的效率和材料的数量，每孔装。我，IV和V配合物通常会产生更强的信号比复合物II和III。
复杂的I（CI）
孵育CI缓冲区（5MM的Tris -盐酸，pH值7.4 2.5mg/ml NBT;为0.1mg/ml NADH）的凝胶片在室温下了好几个小时。
CI为缓冲区：每5MM的Tris - HCl，pH值7.4百毫升添加：
0.01克NADH
0.25克NBT
修复凝胶在50％甲醇和10％醋酸为15-45分钟。固定凝胶是保存在10％醋酸。
复合物Ⅱ（CII）
孵育与CII的缓冲区（20MM琥珀酸钠5MM的Tris - HCl pH值7.4; 0.2MM吩嗪methasulfate; 2.5mg/ml NBT）凝胶片几个小时，在室温下。
CII的缓冲区：每5MM的Tris - HCl，pH值7.4100毫升添加：
200μL1M琥珀酸钠
80μl吩嗪methasulfate（250MM的PMS DMSO溶解）
0.25克NBT
修复复杂所述的凝胶
综合三（CIII）
孵育CIII缓冲区（50MM磷酸钠，pH值7.2; 0.05％3,3' - 二氨基tetrahydrochloride（DAB））的凝胶片在室温下了好几个小时。
CIII缓冲液：每50毫米的钠磷酸盐，pH值7.2100毫升：
50毫克二氨基tetrahydrochloride
修复复杂所述的凝胶
综合四（CIV）
孵育CIV缓冲区（50MM磷酸钠，pH值7.2; 0.05％3,3' - 二氨基tetrahydrochloride（DAB），50μM马心细胞色素c）的凝胶片几个小时，在室温下。
CIV缓冲液：每50毫米的钠磷酸盐，pH值7.2百毫升：
50毫克二氨基tetrahydrochloride
0.1克马心细胞色素c
修复复杂所述的凝胶
综合五（简历）
孵育凝胶片CV缓冲区（35MM三基地，270甘氨酸，pH值8.3在25 ° C，14mm的硫酸镁 ，0.2％W / V PB（NO 3）2，8mm的三磷酸腺苷）在室温下了好几个小时。
CV缓冲液：每100毫升的解决方案中添加：
| 三基 | 0.424克 |
| 甘氨酸 | 2.026克 |
| 硫酸镁 | 0.345克 |
| PB（NO 3）2 | 0.29克 |
无需调整pH值（应该是8.3） - 不使用酸或碱。过滤和添加
| 三磷酸腺苷 | 0.441克 |
修复凝胶在50％甲醇30分钟，并转移到水。
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Discussion
在这段视频中，我们已经描述了从人类胚胎干细胞，他们高分辨率的清晰本地凝胶电泳（hrCNE）分离，以及随后的分析凝胶的催化活性检测线粒体蛋白质复合物的提取。 hrCNE解析线粒体膜蛋白复合物，并在一项决议，与蓝色本地凝胶电泳凝胶活性测定优越。可以采用这种技术不仅量化线粒体呼吸复合物IV也分析，无论是在人类胚胎干细胞和其衍生的后代的任何线粒体膜蛋白复合物的亚基组成。
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Acknowledgments
目前支持人类胚胎干细胞研究在Teitell实验室由加州再生医学研究所（CIRM）种子批RS1 - 00313。我们感谢卡拉克勒博士（加州大学洛杉矶分校）和克勒实验室成员在这些问题和进一步的研究提供意见和见解。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
