Summary
Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.
Abstract
Les mitochondries sont des organites cytoplasmiques qui ont un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire et l'homéostasie, la régulation du réseau de signalisation cellulaire, et la mort cellulaire programmée. Les mitochondries produisent l'ATP, de réglementer l'état redox cytoplasmique et Ca2 + bilan, cataboliser acides gras, de synthétiser l'hème, nucléotides, hormones stéroïdes, acides aminés, et aider à assembler fer-soufre dans les protéines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans la production de chaleur. Les mutations du génome mitochondrial entraîner plusieurs types de trouble humain. L'accumulation de mutations de l'ADNmt est en corrélation avec le vieillissement et est soupçonné d'avoir un rôle important dans le développement du cancer. En raison de leur rôle d'une importance vitale dans tous les types de cellules, la fonction des mitochondries doit aussi être critique pour les cellules souches. Avancées majeures ont été faites dans notre compréhension de la viabilité des cellules souches, la prolifération, et la capacité de différenciation. Mais l'activité fonctionnelle des cellules souches, en particulier de leur état énergétique, ne fut pas encore été étudiés en détail. Presque rien n'est connu sur les propriétés des mitochondries des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et leur descendance différenciée précurseur. Une façon de comprendre et d'évaluer le rôle des mitochondries dans la fonction de CSEh et le potentiel de développement est de mesurer directement l'activité des complexes respiratoires mitochondriaux. Ici, nous décrivons haute résolution électrophorèse sur gel natif claires et les suivants dans la visualisation de l'activité de gel comme une méthode pour analyser les cinq complexes de la chaîne respiratoire des CSEh.
Protocol
Haute Résolution électrophorèse sur gel natif Effacer (hrCNE) pour le complexe mitochondrial tests d'activité dans le gel
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été maintenus sur une monocouche de ˠ-irradiés ou la mitomycine C fibroblastes de souris traitées embryonnaires (MEF), puis passer à la croissance sur Matrigel pendant 5 jours dans MEF milieu conditionné utilisant des conditions standard. Pour enlever la contamination FAE, CSEh ont été re-plaquées sur Matrigel et cultivées en milieu conditionné MEF pour les 3 jours supplémentaires. Immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence Oct-4, SSEA-4 a été utilisé pour confirmer l'absence de différenciation des CSEh.
- Laver les cellules avec des chaudes 1x PBS, pH 7,4, suivis par trypsinisation (1ml de la trypsine 1x par puits dans une plaque à 6 puits) pendant 5 min.
- Ajouter un volume égal d'inhibiteur de trypsine frais (1mg/ml dans du PBS 1X, pH 7,4). Récolte des cellules et centrifuger à 200 g, 5 min, la température ambiante.
- Jeter le surnageant et remettre les cellules granulées de 0,8 - 1.7ml (basée sur la taille du culot cellulaire) de glace isolée tampon froid mitochondries (83mm saccharose; 6.6mm imidazole / HCl, pH 7,0) avec 1 fraîchement préparés "cocktail inhibiteur de protéase. Incuber sur la glace pendant 10 min.
- Dounce cellules avec un homogénéisateur (~ 40 - 50 coups). Stain une aliquote de cellules dounced bleu trypan pour vérifier l'exhaustivité de l'homogénéisation à l'aide d'un microscope optique.
- Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C pour obtenir un brut mitochondrial granulés qui contient également des noyaux et des fragments de cellules plus grandes. Décanter et jeter le surnageant et peser le précipité brut mitochondrial granulés. Le culot peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide, si ce n'est un point d'arrêt.
REMARQUE: centrifugation différentielle ou d'autres basées sur les gradients procédures peuvent être utilisées pour isoler et de percevoir une fraction de membrane mitochondriale pures. Voir réf. 4 pour les détails. Cette approche alternative sera le rendement de l'activité mitochondriale complexes par mg de protéine mitochondriale lieu d'activité complexe par mg de poids cellulaire ou un numéro de cellulaire. La concentration de protéines mitochondriales devra être déterminé après la purification de faire cette comparaison. En outre, un tampon d'isolement différent peut être requis pour cette approche. Pour la solubilisation de la fraction de la membrane mitochondriale pur, voir la note suivante étape 6 ci-dessous. - Solubiliser le brut mitochondrial granulés sur la glace au vortex avec un tampon de solubilisation de la glace froide (50 mM NaCl, 50 mM imidazole / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM d'acide 6-aminohexanoïque). L'acide 6-aminohexanoïque peut être remplacé par le cocktail d'inhibiteur de protéase 1x. Utilisez 35μl de tampon de solubilisation par 20mg de poids à granulés. Ajouter 20 pi de 10% p / v digitonine par 20mg de poids granulés et mélanger en feuilletant le tube. Incuber 5-10 min sur la glace. Dodécyl-bD-maltoside ou le Triton X-100 peut être substitué à la digitonine pour solubiliser les protéines. Le choix du détergent et de sa quantité peuvent affecter la formation de formes multimériques supercomplexes ou des complexes mitochondriaux. Pour plus d'informations, consultez ref.1.
REMARQUE: La quantité de détergent nécessaire pour solubiliser une fraction membranaire mitochondrial pur correspond à un ratio poids du détergent / protéine allant de 2 à 6g / g. Le rapport optimal pour solubiliser les membranes mitochondriales est 2.5g / g pour dodécyl-bD-maltoside, 3g / g pour le triton X-100, et 6g / g pour la digitonine. - Centrifuger le culot solubilisé à 100.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant clair.
- Ajouter un tampon de charge à une finale de 5% p / v de glycérol et 0,01% p / v Ponceau S (utilisation de 50% p / v de glycérol, 0,1% w / v de solution de chargement Ponceau S stock tampon).
- Charger des puits du gel avec un volume qui contient 20-40mg du brut culot de mitochondries par voie. Utilisez un gel à gradient d'acrylamide (4 -13%) avec un empilage de 3,5% de gel.
REMARQUE: préparation de gel et les conditions de l'électrophorèse:
Pour la préparation du gel, utiliser un acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mélanger comme suit: 48g d'acrylamide et 1,5 g de bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Si T est la concentration totale d'AA et bisAA et C est le pourcentage de réticulant (bisAA) au total des monomères).
Gel de tampon (3 '): 1,5 M acide 6-aminohexanoïque; 75mm imidazole, pH 7,0
| Gel de gradient: | 4% | 13% | Empilement de gel: | 3,5% |
| AA / 3 mix bisAA | 2 ml | 6,5 ml | 0,6 ml | |
| Gel de tampon 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | 2,7 ml | |
| Glycérol | 5 g | |||
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | 4,7 ml | |
| Le volume total | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| APS 10% | 139 ul | 125 pi | 67 ul | |
| TEMED | 14 ul | 12,5 ul | 6,7 ul |
Anode tampon: 25mm imidazole / HCl, pH 7,0
Buffer Cathode: Tricine 50 mM, 7,5 mm d'imidazole / HCl, 0,02% p / v dodécyl-bD-maltoside, 0,05% p / v désoxycholate, pH 7,0
Verser et exécuter des gels dans une chambre froide (4-7 ° C). La tension initiale utilisée est de 100V. Lorsque l'échantillon est entré dans le gel de concentration, la tension est élevée à 500V avec le courant limité à 15mA (pour 0,15 '14' 14 cm gels). L'électrophorèse est arrêté après 3-4 h quand la ligne forte de colorant du rouge Ponceau S se rapproche de la première gel. Alternativement, un gel peut être exécuté pendant la nuit avec une tension constante à 70-100V.
- Tests d'activité dans le gel. Le temps d'incubation pour chaque dosage dépend de l'efficacité de la solubilisation des protéines et la quantité de matière chargée par puits. Complexes I, IV et V donnent habituellement des signaux plus forts que des complexes II et III.
Complexe I (CI)
Incuber la tranche de gel avec CI tampon (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) à température ambiante pendant plusieurs heures.
CI mémoire tampon: Ajouter de 5 mm par 100 ml de Tris-HCl, pH 7,4:
0,01 g NADH
0.25g NBT
Fixer le gel dans du méthanol à 50% et 10% d'acide acétique pour les 15-45 min. Le gel fixe est conservé dans l'acide acétique à 10%.
Complexe II (CII)
Incuber la tranche de gel avec des CII tampon (20 mM de sodium succinate; methasulfate phénazine 0.2mm; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) à température ambiante pendant plusieurs heures.
CII mémoire tampon: Ajouter de 5 mm par 100 ml de Tris-HCl, pH 7,4:
200 pl de succinate de sodium 1M
Methasulfate phénazine 80μl (PMS 250mm dissous dans du DMSO)
0.25g NBT
Fixer le gel comme décrit pour le complexe I
Complexe III (CIII)
Incuber la tranche de gel avec CIII tampon (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2, de 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB)) à température ambiante pendant plusieurs heures.
CIII tampon: Ajouter par 100 ml de phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2:
Tétrachlorhydrate diaminobenzidine 50mg
Fixer le gel comme décrit pour le complexe I
Complexe IV (CIV)
Incuber la tranche de gel avec CIV tampon (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2, de 0,05% de 3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB), 50 microns cheval de coeur du cytochrome c) à température ambiante pendant plusieurs heures.
CIV tampon: Ajouter par 100 ml de phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2:
Tétrachlorhydrate diaminobenzidine 50mg
0.1g cheval de coeur du cytochrome c
Fixer le gel comme décrit pour le complexe I
Complexe V (CV)
Incuber la tranche de gel avec CV de tampon (Tris-35mm de base, 270mm de glycine, pH 8,3 à 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% p / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) à température ambiante pendant plusieurs heures.
CV de tampon: 100ml de solution par ajouter:
| Base Tris | 0.424g |
| Glycine | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Pas besoin d'ajuster le pH (qui devrait être 8.3) - ne pas utiliser d'acide ou de base. Filtrez et ajoutez
| ATP | 0.441g |
Fixer le gel dans du méthanol à 50% pendant 30 minutes et le transfert à l'eau.
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Discussion
Dans cette vidéo, nous avons décrit l'extraction des complexes de protéines mitochondriales de cellules souches embryonnaires humaines, leur séparation par électrophorèse haute résolution claire gel natif (hrCNE), et l'analyse subséquente par en gel des essais d'activité catalytique. hrCNE résout mitochondriale des complexes protéine membranaire à une résolution comparable à celle de l'électrophorèse sur gel bleu natif et est supérieure pour les tests d'activité dans le gel. Cette technique peut être employée non seulement pour quantifier respiratoire mitochondriale des complexes IV, mais aussi d'analyser la composition de tout sous-unité complexe de protéines de membrane mitochondriale fois dans les CSEh et leur progéniture dérivés.
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Acknowledgments
Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont actuellement pris en charge par une California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions le Dr Carla Koehler (UCLA) et des membres du laboratoire Koehler de fournir des conseils et des idées dans ces domaines et des études supplémentaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | adjust pH to 8.0 with NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH) | EMD Millipore | 9010 | store at 4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | store at 4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at –20 C. |
| 10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization) | Fluka | 37008-1G | Dissolved in water. Store 0.1–1 ml aliquots at –20 C. Should be warmed up to 95 C before use. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | store at 4 C |
| 10x Ponceau S/glycerol stock solution | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water. |
| 10% w/v sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, minimum 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c From horse heart | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Store at – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Trypsin Inhibitor | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
References
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
