Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Summary

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Abstract

Pluripotentie kan worden geïnduceerd in gedifferentieerde murine door virale transductie van Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc (Takahashi en Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007;. Okita, et al., 2007;.. Maherali, et al., 2007). We hebben bedacht een herprogrammering strategie waarbij deze vier transcriptiefactoren worden uitgedrukt van doxycycline (DOX)-induceerbare lentivirale vectoren (Brambrink et al.., 2008). Met behulp van deze induceerbare constructen, kunnen we afleiden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen van muis embryonale fibroblasten (MEFs). In deze video, tonen we de procedure voor het genereren van induceerbare lentivirussen dat de vier transcriptiefactoren te uiten en te laten zien hoe MEFs infecteren met deze virussen om iPS cellen te produceren. Door het gebruik van induceerbare lentivirussen, de uitdrukking van de vier factoren in gecontroleerde door de toevoeging van doxycyline aan het kweekmedium. Het voordeel van dit systeem in de traditionele retrovirale infectie is de mogelijkheid om de genen aan-en uitzetten, zodat de kinetiek van herprogrammering en genexpressie eisen kan worden in detail geanalyseerd.

Protocol

Stap 1:

Ontdooien 293-cellen en de plaat voor lentivirus productie.

1. Bereid 9 ml DMEM + medium in een 15 ml buis.
2. Verwijder een flacon van bevroren 293 aandelen uit de vloeibare stikstof tank en zet de flacon in een 37 ° C waterbad tot de meeste (maar niet alle) cellen worden ontdooid.
3. Verwijder de cellen van het bevriezen flacon en plaats in de 15 ml buis vanaf stap 1.
4. Centrifugeer bij 180g gedurende 5 minuten, en gooi het supernatant.
5. Resuspendeer de cellen met 10 ml DMEM + medium, en over te dragen aan een gelatine gecoate 100-mm schotel. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO ₂ incubator tot ze 80-90% confluent.
6. Passage van de 293 cellen: cellen wassen met PBS, aspiratie van de PBS, en voeg 4 ml per 10 cm schotel van 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, en incubeer gedurende 1 min bij 37 ° C.
7. Los cellen van gerechten door te tikken, mengen met 10 ml DMEM + medium, en over te dragen aan een 15-ml-buis. Centrifugeer bij 180g gedurende 5 minuten, en zuig het supernatant.
8. Voeg het juiste volume van DMEM + medium, en breken de cellen in een enkele cel schorsing door en neer te pipetteren meerdere malen.
9. Tel het aantal cellen en pas de concentratie 8x10 ⁵ cellen per ml met OH medium.
10. Zaad cellen op 8x10 ⁶ cellen (10 ml) per 100-mm cultuur schotel, en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO _2.

Stap 2:

Transfecteren 293 cellen met lentivirus plasmiden en de oogst virus

1. Voor elke 10-cm plaat, gebruik 10 pg FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 of c-Myc) lentivirus ruggengraat met 2.5ug van de PMD-G en 7,5 ug van pPax2.
2. Terwijl aliquoting de drie plasmiden in een buis, te leveren 30μl van Fugene 6 transfectiereagens in een tweede buisje met 500μl van DMEM zonder serum en meng voorzichtig met de vinger te tikken en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Voeg de DNA mix drop-door-drop in de Fugene 6/DMEM-containing buis, meng door de vingers te tikken en incubeer gedurende 20 minuten.
4. Voeg de DNA / Fugene 6 complex druppelsgewijs in de schaal van 293, en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO _2.
5. De volgende ochtend: Zuig de transfectiereagens-bevattend medium, voeg 5 ml vers ES-cel-medium, en de cellen naar de incubator terug te keren.
6. Op 48 uur en 72 uur na transfectie, het verzamelen van het medium van de 293's met behulp van een 10-ml steriele wegwerpspuit, filteren door een 0,45-um poriën cellulose-acetaat filter, en de overdracht in een 15 ml buis.
7. Concentreer het virus supernatant door ultracentrifugatie. Resuspendeer de virus pellet in gewenste volume en maak amixture van gelijke delen van het medium dat Oct-3/4-, Sox2-, Klf4-en c-Myc-lentivirussen.
8. Tijdens het maken van het virus, bereiden Oct4-neo/rtTA of Oct4-GFP/rtTA MEF (passage <3) tot 90% confluentie in 10-cm gerechten (2x10 ⁶ cellen per schaaltje)
9. Aspireren het kweekmedium en wassen met 10 ml PBS.
10. Gooi PBS, voeg 1 ml per schotel van 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, en bij 37 ° C incubeer gedurende 10 minuten.
11. Voeg 9 ml van het kweekmedium, schorten de cellen van een enkele cel, en over te dragen aan een 15-ml-buis.
12. Tel het aantal cellen, en pas de concentratie 8x10 ⁴ cellen per ml. Breng 10 ml celsuspensie (8x10 ⁵ cellen) om een 10-cm schotel bedekt met gelatine. 'S nachts Incubeer de schotel op 37 ° C, 5% CO _2.
13. Zuig het medium van een fibroblast schaal, en voeg 10 ml van het virus-bevattend medium. Incubeer de cellen van 4 uur tot 's nachts bij 37 ° C, 5% CO _2.
14. Na 24 aspireren het medium van een fibroblast schaal, en voeg 10 ml vers ES-cel medium.
15. Vervang regelmatig ES-cel medium met een medium dat Doxycycline om de expressie van de vier genen initiëren, met andere woorden, start herprogrammering.
16. Bij gebruik van een Oct4-neo reporter, dan starten drug sectie elk moment tussen de 6 en 9 dagen.
17. Verander het medium elke dag tot de kolonies worden groot genoeg om opgehaald te worden. Kolonies moet eerst zichtbaar worden ongeveer een week na de start van de herprogrammering. Ze moeten groot genoeg om opgehaald te worden rond dag 20.

Stap 3:

Het afhalen van de iPS kolonies

De dag voor Picking:

1. Zaad het vereiste aantal van gelatine-gecoate 24-well platen met γ-bestraalde DR4 MEFs

Picking Klonen op dag 1:

1. Voer de kolonies op de platen 1-2 uur voor het plukken.
2. Voeg 15 pi PBS aan de putjes van een V-vormige 96-wells schotel.
3. Was het schaaltje met de koloniën een keer worden geplukt met PBS en voeg 10 ml van PBS aan het gerecht.
4. Kies de kolonies met de kleine 5μl pipetpunten (zet de P20 Pipetman op 4 pi). Overdracht colonies naar een put in de 96-wells schotel.
5. Voeg 20 ui van trypsine aan elk putje met behulp van de multi-channel (12) pipetor. Pipet op en neer 3 keer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 minuten.
6. Voeg 100 ul van ES medium om de getrypsiniseerd koloniën. Pipet op en neer 10 keer. Transfer 6 klonen op een tijd van de 96-well schotel naar een 24-well gerecht met behulp van een tip op elke andere plaats op de 12 plaats pipetor.
7. Groeien de cellen op de 24-well plaat in een 37 ° C, 5% CO ₂ incubator totdat de cellen te bereiken 80-90% confluentie, het voeden dagelijks met ES-cel medium. Cellen zullen waarschijnlijk klaar zijn om uit te breiden in 3-7 dagen.

Stap 4

1. Uitbreiding van iPS cellen
   1. Zuig het medium, en was de cellen met 1 ml PBS.
   2. Volledig te verwijderen PBS, voeg 0,1 ml van 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
   3. Voeg 0,4 ml van de ES medium en schorten de cellen door en neer te pipetteren tot enkele celsuspensie.
   4. Breng de celsuspensie om een goed van de 6-well plaat, voeg 1,5 ml ES-cel-medium, en incuberen in een 37 ° C, 5% CO ₂ incubator tot de cellen te bereiken 80-90% confluentie in 6-wells platen. Op dit punt, voor te bereiden bevroren voorraad van de cellen, als volgt.
2. De voorbereiding van bevriezen voorraad
   1. Zuig het medium, en was de cellen met 2 ml PBS.
   2. Volledig te verwijderen PBS, voeg 0,5 ml van 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
   3. Voeg 2 ml van de ES medium en schorten de cellen door en neer te pipetteren tot enkele celsuspensie.
   4. Breng de celsuspensie om een ​​15-ml tube, tel het aantal cellen en spin down van de cellen.
   5. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen met ES medium om de concentratie bij 2x10 ⁶ cellen per ml.
   6. Bereid 2 ES-cel bevriezing medium (20% DMSO in ES medium) en aliquot het op 0,5 ml per flacon.
   7. Overdracht 0,5 ml van de celsuspensie om flesjes te bevriezen en meng.
   8. Doe de injectieflacons in een cel-invriezen container en houd het bij -80 ° C gedurende de nacht, over te dragen aan vloeibare stikstof de volgende dag voor de lange termijn opslag.

Discussion

In deze video laten we zien hoe een induceerbaar, lentivirale systeem te gebruiken om GFP-positieve, pluripotente iPS cellen van MEFs afgeleid van Oct4-GFP/R26-M2rtTA en Nanog-GFP/R26-M2rtTA muizen te genereren. Deze procedure is een bruikbare methode voor het genereren van iPS cellen, omdat het zorgt voor de controle van transgenexpressie tijdens de herprogrammering proces. Hoewel het gebruik van virussen in de generatie van iPS cellen belemmert het gebruik van deze cellen in een klinische setting is deze procedure kunnen we enkele van de belangrijkste biologische vragen die het nog niet gedefinieerd herprogrammering proces te benadrukken beantwoorden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G