Summary
यह वीडियो प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पैदा inducible lentivirus का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया से पता चलता है कि व्यक्त Oct4, Sox2, सी Myc और Klf4.
Abstract
Oct4 के वायरल पारगमन द्वारा pluripotency विभेदित murine में प्रेरित किया जा सकता है, Sox2, Klf4, और सी Myc (Takahashi और Yamanaka, 2006; Wernig, एट अल, 2007; Okita, एट अल, 2007;. Maherali, एट अल, 2007). हम एक reprogramming की रणनीति में जो इन चार प्रतिलेखन कारकों डॉक्सीसाइक्लिन से व्यक्त कर रहे हैं तैयार कर लिया है (Dox) lentiviral वैक्टर (Brambrink एट अल., 2008)-inducible. इन inducible constructs का उपयोग करना, हम माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (आईपीएस) प्राप्त कर सकते हैं. इस वीडियो में, हम inducible lentiviruses कि चार प्रतिलेखन कारक व्यक्त और शो कैसे इन वायरस के साथ MEFs संक्रमित करने के क्रम में आईपीएस कोशिकाओं के उत्पादन की पीढ़ी के लिए प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. Inducible lentiviruses का उपयोग करके, चार कारकों doxycyline की संस्कृति के माध्यम से अलावा द्वारा नियंत्रित की अभिव्यक्ति. पारंपरिक रेट्रोवायरल संक्रमण से अधिक इस प्रणाली के लाभ पर जीन चालू और बंद इतना है कि reprogramming और जीन अभिव्यक्ति आवश्यकताओं के कैनेटीक्स में विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता करने की क्षमता है.
Protocol
चरण 1:
293 lentivirus उत्पादन के लिए कोशिकाओं और थाली पहले गला लें.
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में DMEM + मध्यम के 9 मिलीलीटर तैयार करें.
- तरल नाइट्रोजन टैंक से जमी 293 शेयरों की एक शीशी निकालें और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी डाल तक सबसे कोशिकाओं (लेकिन सभी नहीं) thawed हैं.
- चरण 1 से 15ml ट्यूब में ठंड शीशी और जगह से कोशिकाओं निकालें.
- 5 मिनट के लिए 180g में अपकेंद्रित्र, और फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- DMEM + माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं Resuspend, और एक जिलेटिन लेपित पकवान 100 मिमी के लिए स्थानांतरण. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं सेते हैं जब तक वे 80-90% मिला हुआ हैं .
- 293 कोशिकाओं के पारित होने पीबीएस के साथ धोने कोशिकाओं, Pbs aspirate, और 0.05% trypsin/0.53 मिमी EDTA के 10 सेमी पकवान प्रति 4 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 में 1 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- व्यंजनों से दोहन द्वारा कोशिकाओं, 10 मिलीलीटर मध्यम + DMEM के साथ resuspend, और 15 मिलीलीटर की एक ट्यूब स्थानांतरण अलग. 5 मिनट के लिए 180g में अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- DMEM + माध्यम की उचित मात्रा में जोड़ें, और ऊपर और नीचे pipetting कई बार एकल कक्ष निलंबन में कोशिकाओं को तोड़ने.
- कक्षों की संख्या की गणना और 8x10 एफपी मध्यम के साथ 5 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं एकाग्रता समायोजित.
- बीज कोशिकाओं 8x10 100 मिमी संस्कृति डिश प्रति 6 कोशिकाओं (10 मिलीलीटर) पर, और 37 पर रातोंरात सेते ° सी, 5% सीओ 2.
चरण 2:
Transfect lentivirus plasmids और फसल वायरस के साथ 293 कोशिकाओं
- 10 सेमी की एक थाली के लिए, FUW - tetO - सीडीएनए के 10 μg (Oct4, Sox2, Klf4 या सी Myc) lentivirus PMD के 2.5ug जी के साथ रीढ़ की हड्डी और pPax2 के 7.5 μg का उपयोग करें.
- जबकि एक ट्यूब में तीन plasmids aliquoting, एक दूसरे DMEM के सीरम के बिना 500μl युक्त ट्यूब में Fugene 6 अभिकर्मक अभिकर्मक के 30μl देने और दोहन उंगली और सेते द्वारा धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण.
- डीएनए Fugene 6/DMEM-containing ट्यूब में ड्रॉप द्वारा ड्रॉप मिश्रण जोड़ें और 20 मिनट के लिए उंगली दोहन सेते द्वारा धीरे मिश्रण.
- / डीएनए Fugene 6 जटिल dropwise 293 के पकवान में जोड़ें, और 37 पर रातोंरात सेते ° सी, 5% सीओ 2.
- अगली सुबह: Aspirate अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त मध्यम, ताजा ES सेल के माध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ने, और इनक्यूबेटर करने के लिए कोशिकाओं लौटने.
- अभिकर्मक के बाद 48 घंटे और 72 घंटे में, 293 से एक 10 मिलीलीटर बाँझ डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करके मध्यम, यह एक ताकना 0.45 सुक्ष्ममापी आकार सेलूलोज़ एसीटेट फिल्टर के माध्यम से एकत्र फ़िल्टरिंग, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित.
- Ultracentrifugation द्वारा वायरस की सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ. वांछित मात्रा में वायरस गोली Resuspend और Oct-3/4-, Sox2 - Klf4 और सी Myc lentiviruses युक्त माध्यम के बराबर भागों amixture बनाने.
- जबकि वायरस बनाने, 10 सेमी बर्तन में 90 confluency% Oct4-neo/rtTA या Oct4-GFP/rtTA MEFs (<बीतने 3) (6 प्रति 2x10 पकवान कोशिकाओं) तैयार
- पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ संस्कृति मध्यम और धोने Aspirate.
- पीबीएस त्यागें, 0.05% trypsin/0.53 मिमी EDTA के प्रति पकवान 1 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 पर सेते ° C 10 मिनट के लिए.
- संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर जोड़ें, किसी एकल कक्ष के लिए कक्षों को स्थगित करता है, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- कक्षों की संख्या की गणना, और 8x10 मिलीलीटर प्रति 4 कोशिकाओं एकाग्रता समायोजित . जिलेटिन के साथ एक 10 सेमी पकवान लेपित सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर (5 कोशिकाओं 8x10) स्थानांतरण. पकवान 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2.
- एक fibroblast पकवान से मध्यम Aspirate, और वायरस युक्त मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें. 37 में 4 घंटे से रात भर के लिए कोशिकाओं ° सी, 5% सीओ 2 सेते हैं.
- 24 के बाद एक fibroblast पकवान से माध्यम aspirate, और ताजा ES सेल के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ें.
- मध्यम युक्त डॉक्सीसाइक्लिन के साथ नियमित रूप से ES सेल माध्यम बदलें चार जीनों की अभिव्यक्ति आरंभ करने के लिए, दूसरे शब्दों में, reprogramming आरंभ.
- यदि एक संवाददाता Oct4 - नव का उपयोग कर, फिर 6 और 9 दिनों के बीच कभी भी दवा अनुभाग आरंभ करें.
- मध्यम जब तक कालोनियों काफी बड़ा है उठाया हो हर दिन बदलें. कालोनियों पहली बार दिखाई reprogramming की दीक्षा के बाद लगभग एक सप्ताह हो जाना चाहिए. वे काफी बड़े के लिए 20 दिन के आसपास उठाया जा बन जाना चाहिए.
चरण 3:
आईपीएस कालोनियों उठा
उठा पहले दिन:
- बीज γ विकिरणित DR4 MEFs के साथ जिलेटिन लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों के अपेक्षित संख्या
दिवस 1 पर क्लोन उठा:
- प्लेटों पर 1-2 घंटे उठा से पहले कालोनियों का फ़ीड.
- पीबीएस के 15 μl वी तली 96 अच्छी तरह से पकवान के कुओं को जोड़ें.
- कालोनियों पीबीएस के साथ एक बार उठाया युक्त डिश धोने और पकवान पीबीएस के 10ml जोड़ने.
- छोटे 5μl pipet सुझावों (4 μl पर P20 pipetman सेट) के साथ कालोनियों उठाओ. स्थानांतरण सह96 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए lonies.
- अच्छी तरह से (12) मल्टी चैनल pipetor का उपयोग कर प्रत्येक के लिए trypsin के 20 μl जोड़ें. Pipet और 3 बार नीचे. 37 में सेते ° C 4 मिनट के लिए.
- Trypsinized कालोनियों ES माध्यम के 100 μl जोड़ें. Pipet और 10 बार नीचे. पकवान 96 अच्छी तरह से एक समय में 6 क्लोन 24 अच्छी तरह से 12 जगह pipetor पर हर दूसरे स्थान पर एक टिप का उपयोग पकवान पर स्थानांतरण.
- 24 अच्छी तरह से थाली पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित जब तक कोशिकाओं confluency 80-90% तक पहुँच, ES सेल के माध्यम से दैनिक खिला . कक्ष शायद 3-7 दिनों में विस्तार करने के लिए तैयार हो जाएगा.
चरण 4
- आईपीएस कोशिकाओं का विस्तार
- मध्यम Aspirate, और पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो.
- पीबीएस पूरी तरह से हटाने के लिए, 0.25% trypsin / 1 मिमी EDTA सेते और 37 ° 10 मिनट के लिए सी के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें.
- ES माध्यम से 0.4 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting और एकल कक्ष निलंबन के नीचे कोशिकाओं को निलंबित.
- 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण सेल निलंबन, 1.5 मिलीलीटर ES सेल मध्यम जोड़ने के लिए, और 37 में एक सेते ° सी, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर जब तक कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें में 80-90 confluency% तक पहुँचने. इस बिंदु पर, कक्षों की जमी स्टॉक तैयार है, निम्नानुसार है.
- फ्रीज शेयर की तैयारी
- मध्यम Aspirate, और पीबीएस के 2 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं को धो.
- पीबीएस पूरी तरह से हटाने के लिए, 0.25% trypsin / 1 मिमी EDTA सेते और 37 ° 10 मिनट के लिए सी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
- ES माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting और एकल कक्ष निलंबन के नीचे कोशिकाओं को निलंबित.
- 15 मिलीलीटर की एक ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण करने के लिए, कक्षों की संख्या गिनती और नीचे कोशिकाओं स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 2x10 मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं पर एकाग्रता के लिए ES माध्यम से कोशिकाओं resuspend.
- 2 ES सेल ठंड (ES मध्यम में 20% DMSO) मध्यम और यह शीशी प्रति 0.5 मिलीग्राम पर विभाज्य तैयार.
- सेल निलंबन की 0.5 मिलीलीटर का स्थानांतरण शीशियों स्थिर और धीरे मिश्रण.
- सेल ठंड एक कंटेनर में शीशियों रखो और यह -80 पर रखने ° रात भर सी, तरल नाइट्रोजन के लिए लंबी अवधि के भंडारण के लिए अगले दिन हस्तांतरण.
Discussion
इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कैसे एक inducible, lentiviral प्रणाली का उपयोग करने के लिए GFP पॉजिटिव MEFs से pluripotent आईपीएस कोशिकाओं Oct4-GFP/R26-M2rtTA और Nanog-GFP/R26-M2rtTA चूहों से प्राप्त उत्पन्न. यह प्रक्रिया आईपीएस कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक उपयोगी तरीका है क्योंकि यह reprogramming प्रक्रिया के दौरान transgene अभिव्यक्ति के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. हालांकि आईपीएस कोशिकाओं की पीढ़ी में वायरस का उपयोग एक नैदानिक सेटिंग में इन कोशिकाओं के उपयोग में बाधा उत्पन्न करती है, हमें इस प्रक्रिया के कुछ प्रमुख जैविक सवाल है कि अभी तक परिभाषित reprogramming प्रक्रिया को रेखांकित जवाब देने के लिए सक्षम करता है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Reagent | Sigma-Aldrich | D9891-100G |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Maherali, N., et al. Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
