삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Summary

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

Abstract

Pluripotency는 Oct4의 바이러스 도입하여 차별 murine에서 유도된 수 있습니다 Sox2, Klf4, 그리고 C - Myc (타카하시와 야마 나카, 2006; Wernig, 외, 2007;. 오키타, 외, 2007;.. Maherali, 외, 2007). 우리는이 네 전사 요소 doxycycline에서 표현되는 프로그래밍 전략을 고안해야 (독스) lentiviral 벡터 (Brambrink 외., 2008) - inducible. 이러한 inducible 구조를 사용하여, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)에서 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포를 유도하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 네 개의 전사 요소를 표현하고 IPS 세포를 생산하기 위해이 바이러스를 감염 MEFs하는 방법을 보여줍니다 inducible의 lentiviruses의 생성에 대한 절차를 설명합니다. inducible의 lentiviruses를 사용하여, 문화 매체 doxycyline의 추가에 의해 제어의 4 가지 요소의 표현. 전통 retroviral 감염을 통해이 시스템의 장점은 프로그래밍과 유전자 발현 요구 사항의 반응 속도론은 세부 분석 수 있도록 해제에 대한 유전자를 켜고있는 능력입니다.

Protocol

1 단계 :

lentivirus 생산을위한 293 세포와 플레이트를 녹여.

1. 15 - ML 튜브 DMEM + 중간 9 ML을 준비합니다.
2. 액체 질소 탱크에서 냉동 293 주식의 병을 제거하고 (전부는 아니지만) 대부분의 세포가 해동 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 병을 넣어.
3. 1 단계에서 15ml 튜브에 동결 유리병과 장소에서 세포를 제거합니다.
4. 5 분 180g에 원심 분리기 다음 뜨는 폐기하십시오.
5. DMEM + 중간의 10 ML있는 세포를 Resuspend 및 젤라틴 코팅 100 - mm 요리로 전송할 수 있습니다. 그들이 80~90%의 합류하기 전까지 37 ° C 5 % CO ₂ 배양기에서 세포를 품어.
6. 293 세포의 통과 : PBS로 세척 세포는 PBS를 대기음, 그리고 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 cm 요리마다 4 ML을 추가, 37 1 분 품어 ° C.를
7. 10 ML DMEM + 매체 resuspend 감청하여 요리의 세포, 그리고 15 - ML 튜브로 전송을 분리합니다. 5 분 180g에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음.
8. DMEM + 매체의 적절한 볼륨을 추가하고 몇 시간을 아래와 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 헤어지게.
9. 세포의 개수를 카운트 및 FP 매체와 ML 당 8x10 ⁵ 세포에 농도를 조정합니다.
10. 종자 100 - mm 배양 접시 당 8x10 ⁶ 셀 (10 ML)에서 세포를, 그리고 37 밤새 품어 ° C, 5 % CO _2.

2 단계 :

lentivirus의 plasmids과 수확 바이러스 Transfect 293 세포

1. 각 10 cm 접시, FUW - 테토 - cDNA 10 μg (Oct4, Sox2, Klf4 또는 C - Myc) pMD - G의 2.5ug와 lentivirus 백본 및 pPax2의 7.5 μg을 사용합니다.
2. 튜브로 세 plasmids를 aliquoting 동안 혈청없이 DMEM의 500μl를 포함하는 두 번째 튜브로 Fugene 6 transfection 시약의 30μl를 제공하고 실온에서 5 분 도청 손가락과 부화에 의해 부드럽게 섞는다.
3. DNA 믹스 Fugene 6/DMEM-containing 튜브에 드롭하여 놓기를 추가, 20 분 손가락 도청 및 부화하여 부드럽게 섞는다.
4. 293의 그릇에 DNA / Fugene 6 복잡한 dropwise을 추가하고 37 밤새 품어 ° C 5 % CO _2.
5. 다음날 아침 : transfection을 대기음 시약 함유 매체를 신선한 ES 세포 매체의 5 ML을 추가하고, 배양기에 세포를 반환합니다.
6. 48 시간 transfection 후 72시간에서 0.45 - μm의 기공 크기 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 필터링, 15 ML 튜브로 전송할 수, 10 ML 멸균 일회용 주사기를 사용하여 293의에서 매체를 수집합니다.
7. ultracentrifugation하여 바이러스 뜨는을 집중. 원하는 볼륨의 바이러스 펠렛을 Resuspend하고 Oct-3/4-, Sox2 -, Klf4 및 C - Myc - lentiviruses을 포함하고있는 매체의 동등한 부분 amixture합니다.
8. 바이러스를 만드는 동안, (접시 당 2x10 ⁶ 셀) 10 - cm 요리 confluency 90 % Oct4-neo/rtTA 또는 Oct4-GFP/rtTA MEFs을 (통과 <3) 준비
9. PBS 10 ML과 문화 미디어와 세척을 대기음.
10. 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 접시 당 1 ML을 추가하고, 37 품어 ° C, 10 분, PBS 폐기하십시오.
11. 문화 매체 9 ML 추가, 단일 세포로 세포를 중단하고, 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
12. 세포의 수를 계산하고, ML 당 8x10 ⁴ 세포에 농도를 조정합니다. 젤라틴 코팅 10 cm 요리에 세포 현탁액 10 ML (8x10 ⁵ 셀)을 전송합니다. 37 밤새 접시를 품어 ° C, 5 % CO _2.
13. fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 그리고 바이러스가 포함된 매체 10 ML를 추가합니다. 37 4 H에서 하룻밤에 세포 ° C 5 % CO ₂ 알을 품다.
14. 24 후 fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 신선한 ES 세포 매체 10 ML를 추가합니다.
15. 네 가지 유전자의 표현을 시작하는 매체를 포함하는 Doxycycline와 함께 정기적으로 ES 세포 매체를 교체, 즉, 프로그래밍을 시작합니다.
16. Oct4 - 네오 기자를 사용한다면, 6 구일 사이에 언제든지 약물 섹션을 시작합니다.
17. 식민지가 뽑힐 정도로 큰이 될 때까지 매일 매체를 변경합니다. 식민지 먼저 프로그래밍의 개시 후 약 일주일 표시가 될 것입니다. 그들은 일 약 20 뽑힐 정도로 커질 것입니다.

3 단계 :

IPS 식민지를 따기

따기 전에 일 :

1. γ - DR4 조사 MEFs과 젤라틴 - 코팅 24 - 잘 접시의 필요한 번호 씨앗

1 일에 클론을 따기 :

1. 1-2시간 따기 전에 접시에 식민지를 공급.
2. V - 바닥 96 잘 요리의 우물에 PBS 15 μl를 추가합니다.
3. 식민지는 PBS로 한번 잡았 수가 들어있는 접시를 씻고 요리에 PBS의 10ml를 추가합니다.
4. 작은 5μl pipet 팁 (4 μl에 P20 pipetman 설정)와 식민지를 선택합니다. 전송 공동96 - 잘 접시에 잘하는 로니스.
5. 잘 멀티 채널 (12) pipetor를 사용하여 각 트립신 20 μl를 추가합니다. Pipet 위아래로 3 회. 37 품어 ° C를 4 분간.
6. trypsinized 식민지로 ES 매체 100 μl를 추가합니다. Pipet 위, 아래로 10 회. 12 장소 pipetor의 모든 다른 위치에 팁을 사용하여 24 잘 요리에 96 잘 요리에서 한 번에 6 클론을 전송합니다.
7. 세포가 ES 세포 매체와 함께 매일 먹이 confluency 80-90%에 도달할 때까지 37 ° C 5 % CO ₂ 배양기에서 24 잘 접시에 세포를 성장. 세포는 아마 3-7일의 확장 준비됩니다.

4 단계

1. IPS 세포의 확장
   1. 매체 기음, 그리고 PBS 1 ML로 세포를 씻어.
   2. 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C의 0.1 ML를 추가합니다.
   3. ES 매체의 0.4 ML를 추가하고 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다.
   4. 6 - 잘 접시의 잘하는 세포 현탁액을 전송, 1.5 ML의 ES 세포 매체를 추가하고, 37 품어 ° C 5 % CO ₂ 배양기 세포는 6 - 잘 접시에 confluency 80-90%에 도달할 때까지. 이 시점에서 다음과 같이, 세포의 냉동 재고를 준비합니다.
2. 프리즈 주식의 준비
   1. 매체 기음, 그리고 PBS 2 ML으로 세포를 씻으십시오.
   2. 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C 0.5 ML를 추가합니다.
   3. ES 매체 2 ML 추가 및 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다.
   4. 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송, 세포의 수를 계산하고 세포를 스핀 다운.
   5. , 뜨는을 삭제 ML 당 2x10 ⁶ 세포에서 농도 ES 매체와 세포 resuspend.
   6. 이 ES 세포 냉동 매체 (ES 매체 20 % DMSO)와 유리병 당 0.5 ML로 나누어지는를 준비합니다.
   7. 튜브를 고정하고 부드럽게 혼합하는 세포 현탁액의 0.5 ML을 전송합니다.
   8. 세포 동결 용기에 튜브를 넣고 ° C 야간은 -80에서 보관, 장기 보관을 위해 다음날 액체 질소로 전송할 수 있습니다.

Discussion

이 비디오에서는, 우리는 Oct4-GFP/R26-M2rtTA과 Nanog-GFP/R26-M2rtTA 생쥐에서 추출한 MEFs에서 GFP 양성, pluripotent IPS 세포를 생성하는 inducible, lentiviral 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그것은 프로그래밍 과정 transgene 표현의 제어를위한 수 있기 때문에이 절차는 IPS 세포를 생성하는 유용한 방법입니다. IPS 세포의 생성에 바이러스의 사용은 임상 환경에서 이러한 세포의 사용을 막는 있지만,이 절차는 우리가 아직 정의 프로그래밍 작업을 밑줄 주요 생물 학적 질문 중 일부에 대답 수 없습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G