Summary
Это видео показывает процедуру для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток использованием индуцибельной лентивирус, которые выражают Oct4, Sox2, с-Myc и Klf4.
Abstract
Плюрипотентности могут быть вызваны в дифференцированных мышиных вирусной трансдукции Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc (Такахаши и Яманака, 2006; Wernig и др., 2007;. Окиты и др., 2007;.. Maherali, и др., 2007). Мы разработали стратегию перепрограммирования, в которых эти четыре фактора транскрипции выражены с доксициклин (DOX)-индуцируемой лентивирусов векторов (Brambrink и соавт., 2008). Используя эти индуцибельной конструкции, можно получить индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPS) клетки мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). В этом видео мы продемонстрируем процедуру поколения индуцибельной лентивирусов, которые выражают четыре фактора транскрипции и показать, как заразить MEFs этими вирусами с целью получения плюрипотентных клеток. При использовании индуцибельной лентивирусов, выражение из четырех факторов контролируется добавлением doxycyline к культуральной среде. Преимущество этой системы по сравнению с традиционным ретровирусной инфекции является способность превращать гены и выключается, так что кинетика перепрограммирования и требования экспрессии генов могут быть проанализированы в деталях.
Protocol
Шаг 1:
Оттепель из 293 клеток и пластины для лентивирус производства.
- Подготовка 9 мл среды DMEM + в 15-мл трубки.
- Удалите флакон замороженные 293 акций из резервуар жидкого азота и положить флакон в 37 ° С водяной бане, пока большинство (но не все) клетки размораживают.
- Удалить клетки от замерзания флакона и поместить в 15 мл трубки с шага 1.
- Центрифуга на 180 в течение 5 мин, а затем удалите супернатант.
- Ресуспендируют клеток с 10 мл среды DMEM +, и трансфер в желатин покрытием 100-мм блюдо. Инкубируйте клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, пока они не 80-90% вырожденная.
- Прохождение 293 клеток: мыть клетки с PBS, аспирация PBS, и добавить 4 мл на 10-см блюдо 0,05% trypsin/0.53 мМ ЭДТА, и инкубировать в течение 1 мин при 37 ° C.
- Отсоедините клетки из блюд, коснувшись, ресуспендируют с 10 мл DMEM + среда, и трансфер в 15-мл трубки. Центрифуга на 180 в течение 5 мин, а аспирация супернатант.
- Добавить соответствующий объем DMEM + среда, и распадаются клеток в суспензии отдельных клеток с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Подсчитайте количество клеток и регулировать концентрацию до 8x10 5 клеток на мл со средним ПС.
- Семенной клеток 8x10 6 клеток (10 мл) на 100-мм культуры блюдо, и инкубировать в течение ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
Шаг 2:
293 трансфекции клеток с лентивирус плазмиды и урожай вируса
- Для каждого 10-см пластинки, использование 10 мкг FUW-Тето-кДНК (Oct4, Sox2, Klf4 или с-Myc) лентивирус позвоночника с 2.5ug из PMD-G и 7,5 мкг pPax2.
- Хотя aliquoting три плазмиды в трубку, доставить 30μl из Fugene 6 трансфекции реагента во вторую пробирку, содержащую 500 мкл в DMEM без сыворотки и аккуратно перемешать пальцем разговоров и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Добавить смесь ДНК капельный в Fugene 6/DMEM-containing трубку, аккуратно перемешать, нажав пальцем и инкубировать 20 мин.
- Добавить ДНК / 6 Fugene комплекса по каплям в блюдо из 293, и инкубировать в течение ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
- На следующее утро: Аспирируйте трансфекции реагента среде, содержащей, добавляют 5 мл свежей среды ячейки ES, и вернуть клеткам инкубатора.
- В 48 часов и 72 часа после трансфекции, собирать среды из 293, используя 10-мл стерильного одноразового шприца, фильтрации его через 0,45-мкм Размер пор фильтра ацетата целлюлозы, а также передачи в 15-мл трубки.
- Концентрат вирус супернатант ультрацентрифугирования. Ресуспендируют вирус шарик в нужном объеме и сделать amixture из равных частей среде, содержащей Oct-3/4-, Sox2-, Klf4-и с-Myc-лентивирусов.
- При принятии вирус, подготовить Oct4-neo/rtTA или Oct4-GFP/rtTA MEFs (проход <3) до 90% слияния в 10-см блюд (2x10 6 клеток на блюдо)
- Аспирируйте питательной среды и промыть 10 мл PBS.
- Отменить PBS, добавьте 1 мл на блюдо 0,05% trypsin/0.53 мМ ЭДТА, и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
- Добавить 9 мл культуральной среды, приостановить клетки одну ячейку, и трансфер в 15-мл трубки.
- Подсчитайте количество клеток и регулировать концентрацию до 8x10 4 клеток на миллилитр. Передача 10 мл клеточной суспензии (8x10 5 клеток) для 10-см блюдо покрыта желатином. Инкубируйте блюдо ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
- Аспирируйте среды из фибробластов блюдо, и добавляют 10 мл вируссодержащих среды. Инкубируйте клетки от 4 ч до ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
- После 24 аспирата среды из фибробластов блюдо, и добавить 10 мл свежей среды ячейки ES.
- Замените регулярной среде клетка с ES среде, содержащей Доксициклин инициировать выражение из четырех генов, другими словами, инициировать перепрограммирования.
- При использовании Oct4-нео репортером, затем инициировать наркотиков разделе в любое время между 6 и 9 дней.
- Изменение среды каждый день, пока колонии становятся достаточно большими, чтобы ее взяли. Колонии должны сначала становятся видны примерно через неделю после начала перепрограммирования. Они должны стать достаточно большими, чтобы быть поднятым вокруг 20-й день.
Шаг 3:
Подняв плюрипотентных колонии
День перед выбором:
- Семенной необходимое количество желатина покрытием 24-луночных планшетах с γ-облученных DR4 MEFs
Выбор клонов на 1 день:
- Поток колонии на пластинах за 1-2 часа до сбора.
- Добавить 15 мкл PBS в скважинах V дном 96-луночного блюдо.
- Вымойте блюдо с колониями, чтобы ее взяли сразу с PBS и добавьте 10 мл PBS, чтобы блюдо.
- Выберите колонии с небольшим 5 мкл советы пипетки (набор P20 pipetman на 4 мкл). Передача сотрудничестваЛонис чтобы хорошо в 96-луночного блюдо.
- Добавьте 20 мкл трипсина в каждую лунку использовании многоканальных (12) pipetor. Внесите вверх и вниз три раза. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 минут.
- Добавить 100 мкл ES средних трипсинизировали колоний. Внесите вверх-вниз 10 раз. Передача 6 клонов на время от 96-луночного блюдо, чтобы 24-а блюдо использованием наконечника на каждой второй позиции на 12-е место pipetor.
- Рост клеток на 24-луночного планшета в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, пока клетки достигают 80-90% слияния, питаясь ежедневно со средней ячейки ES. Клетки, вероятно, будет готова к расширению в 3-7 дней.
Шаг 4
- Расширение клетки плюрипотентных
- Аспирируйте среды, и промыть клетки с 1 мл PBS.
- Удалить PBS полностью, добавьте 0,1 мл 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
- Добавить 0,4 мл ES средних и приостановить клетки с помощью пипетки вверх и вниз для суспензии отдельных клеток.
- Передача клеточной суспензии для скважины 6-луночный планшет, добавить 1,5 мл ES клеточной среде, и инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора, пока клетки достигают 80-90% слияния в 6-луночных планшетах. На данный момент, подготовить запас замороженных клеток, следующим образом.
- Подготовка заморозить акции
- Аспирируйте среды, и промыть клетки с 2 мл PBS.
- Удалить PBS полностью, добавить 0,5 мл 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 10 мин.
- Добавить 2 мл ES средних и приостановить клетки с помощью пипетки вверх и вниз для суспензии отдельных клеток.
- Передача клеточной суспензии в 15-мл трубки, подсчитать количество клеток и замедления вращения клетки.
- Удалите надосадочную, ресуспендирования клеток с ES средней концентрации на 2x10 6 клеток на мл.
- Подготовка 2 ЭСК замерзания среды (20% ДМСО в ES среды) и аликвоты его на 0,5 мл на флакон.
- Передача 0,5 мл клеточной суспензии заморозить флаконов и аккуратно перемешать.
- Положите флаконов в камере замораживания контейнер и хранить его при температуре -80 ° С в течение ночи, трансфер в жидком азоте на следующий день для длительного хранения.
Discussion
В этом видео показано, как использовать индуцибельной, лентивирусов систему для генерации GFP-положительных, плюрипотентных клеток из плюрипотентных MEFs основе Oct4-GFP/R26-M2rtTA и Nanog-GFP/R26-M2rtTA мышей. Эта процедура является полезным методом для получения плюрипотентных клетках, поскольку он позволяет контролировать экспрессии трансгена при перепрограммировании процесса. Хотя использование вирусов в поколение клеток плюрипотентных затрудняет использование этих клеток в клинических условиях, эта процедура не позволит нам ответить на некоторые из основных биологических вопросов, которые подчеркивают еще не определены перепрограммирования процесса.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Reagent | Sigma-Aldrich | D9891-100G |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Maherali, N., et al. Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
