Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Summary

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Abstract

Pluripotency farklılaştırılmış murin Oct4 viral transdüksiyon tarafından indüklenen olabilir, Sox2, Klf4, ve c-Myc (Takahashi ve Yamanaka, 2006; Wernig ve ark, 2007; Okita, vd, 2007;. Maherali, et al, 2007). Biz bu dört transkripsiyon faktörleri doksisiklin ifade edildiği bir yeniden programlama strateji geliştirdiler (dox) lentiviral vektörler (Brambrink ve ark, 2008) indüklenebilir. Bu indüklenebilir yapıları kullanarak, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) alınan uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri elde edebilirsiniz. Bu videoda, biz dört transkripsiyon faktörleri ifade ve iPS hücreleri üretmek için bu virüsleri ile enfekte MEFS nasıl göstereceğim indüklenebilir lentiviruses nesil için prosedürü göstermektedir. Indüklenebilir lentiviruses kullanarak, kültür ortamı Doxycyline ek tarafından kontrol dört faktör ifade. Bu sistemin avantajı, geleneksel retroviral enfeksiyon üzerinde, programlama ve gen ekspresyonu gereksinimleri kinetiği ayrıntılı olarak analiz edilebilir kapalı genler açmak ve kapatmak için yeteneğidir.

Protocol

Adım 1:

293 lentivirüs üretim hücreleri ve plaka çözülme.

1. 9 ml, 15 ml tüp DMEM + orta hazırlayın.
2. Dondurulmuş 293 hisse senetlerinin bir şişe sıvı nitrojen tankı çıkarın ve (hepsi değil) en hücreleri çözülmüş kadar 37 ° C su banyosunda flakon koymak.
3. 1. adımı 15ml tüp içine hücreleri dondurma şişe ve yerden çıkarın.
4. 180g az 5 dakika süreyle santrifüj, ve sonra süpernatantı atın.
5. DMEM + orta 10 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve jelatin kaplı 100 mm çanak transfer. Hücrelerin% 80-90 konfluent kadar 37 ° C,% 5 CO ₂ inkübatör inkübe edin.
6. Geçiş: 293 hücreler PBS ile yıkama hücreleri, PBS aspirat ve 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA 10 cm çanak başına 4 ml ve 37 az 1 dakika boyunca inkübe ° C
7. 10 ml DMEM + orta tekrar süspansiyon dokunarak yemeklerinden hücreleri, ve 15 ml tüp transfer ayırın. 180g az 5 dakika süreyle santrifüj, süpernatantı aspirat.
8. DMEM + orta uygun hacmi ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme hücreleri tek bir hücre süspansiyonu break up.
9. Hücrelerin sayısını ve FP orta ml başına 8x10 ⁵ hücre konsantrasyonu ayarlayabilirsiniz.
10. Tohum hücreleri 100 mm kültür çanak başına 8x10 ^{6 hücreli} (10 ml), 37 o gece inkübe ° C,% 5 CO _2.

Adım 2:

Lentivirüs plazmid ve hasat virüsü ile Transfect 293 hücreleri

1. Her 10 cm plaka için, FUW-Teto-cDNA 10 mikrogram (Oct4, Sox2, Klf4 veya c-Myc) PMD-G 2.5ug ile lentivirüs omurga ve pPax2 7.5 mikrogram kullanın.
2. Bir tüp içine üç plazmid aliquoting ederken, DMEM, serum olmadan 500μl içeren ikinci bir tüp içine Fugene 6 transfeksiyon reaktif 30μl teslim ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca parmak-vurma ve inkübe tarafından hafifçe karıştırın.
3. DNA karışımı Fugene 6/DMEM-containing tüpe damla bırak, parmak vurma ve 20 dakika inkübe hafifçe karıştırın.
4. 293 Kullanıcı çanak içine DNA / Fugene 6 karmaşık damla damla ekleyin ve 37 ° gece inkübe ° C,% 5 CO _2.
5. Ertesi sabah: transfeksiyon aspire reaktif içeren orta, 5 ml taze ES hücre orta ekleyin ve hücrelerin inkübatör dönün.
6. 48 saat ve 72 saat sonra transfeksiyon, 0.45 mikron gözenek boyutu selüloz asetat filtre üzerinden filtreleme, ve 15 ml tüp aktarılması, 10 ml steril tek kullanımlık şırınga kullanarak 293 orta toplamak.
7. Ultrasantrifügasyon tarafından virüs süpernatant Konsantre. Istenilen hacmi virüs pelletini tekrar Oct-3/4-, Sox2, Klf4-c-Myc-lentiviruses içeren orta eşit parçaya amixture.
8. Virüs yaparken, (2x10 ⁶ hücre çanak ortalama) 10 cm yemekleri% 90 confluency Oct4-neo/rtTA veya Oct4-GFP/rtTA MEFS (geçit <3) hazırlamak
9. Kültür ortamı ve 10 ml PBS ile yıkama aspire.
10. 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA çanak başına 1 ml ekleyin ve 37 inkübe ° C 10 dakika, PBS atın.
11. 9 ml kültür ortamı, hücreler tek bir hücre için askıya alma, ve 15 ml'lik bir tüp transfer.
12. Hücrelerin sayısını ve 8x10 ml başına ^{4 hücreli} konsantrasyonunu ayarlamak. Jelatin ile kaplı 10 cm çanak 10 ml (8x10 ⁵ hücre) hücre süspansiyonu aktarın. 37 geceleme çanak inkübe ° C,% 5 CO _2.
13. Fibroblast çanak orta aspire ve virüs içeren orta 10 ml ekleyin. 37 gecede 4 saat hücreleri ° C,% 5 CO ₂ inkübe edin.
14. 24 sonra bir fibroblast çanak orta aspirat ve 10 ml taze ES hücre orta ekleyin.
15. Dört genlerin ifade başlatmak için orta içeren Doksisiklin düzenli ES hücre orta yerine, diğer bir deyişle, yeniden programlama başlatmak.
16. Oct4-neo muhabiri kullanıyorsanız, daha sonra 6 ve 9 gün arasında zaman ilaç bölümünü başlatın.
17. Koloniler aldı yeterince büyük olana kadar her gün orta değiştirin. Kolonileri ilk reprogramming başladıktan sonra yaklaşık bir hafta görünür hale gelir. Bunlar, yaklaşık 20 gün kadar alınır kadar büyük haline gelmelidir.

Adım 3:

IPS koloniler toplayıp

Toplama önce Gün:

1. Γ-ışınlanmış DR4 MEFS ile gerekli sayıda jelatin kaplı 24 kuyucuğu Tohum

Gün 1 Klonlar Toplama:

1. 1-2 saat almadan önce plakalar üzerinde koloniler besleyin.
2. Bir V-96-iyi dipli çanak kuyulardan 15 ul PBS ekleyin.
3. Kolonileri PBS ile bir kez alınır içeren çanak yıkayın ve çanak PBS 10ml eklemek.
4. Koloniler küçük 5μl pipetlemeyin ipuçları (4 ul P20 Pipetman ayarlamak) ile seçin. Transferi co96-iyi yemek, iyi bir lonies.
5. Tripsin 20 ul ve multi-kanal (12) pipetor kullanarak her ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı 3 kez. 37 ° C'de 4 dakika.
6. 100 ES orta ul tripsinize koloniler ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı 10 kez. 12 yerde pipetor diğer her konumda bir ipucu kullanarak 24-iyi bir yemek için 96-iyi çanak bir defada 6 klonları aktarın.
7. 24 plaka hücreler hücrelerin ES hücre orta ile günlük beslenme,% 80-90 confluency ulaşıncaya kadar 37 ° _C,% 5 CO2 inkübatör büyütün. Hücreler muhtemelen 3-7 gün içinde genişletmek için hazır olacak.

Adım 4

1. IPS hücreleri genişletilmesi
   1. Orta aspire, hücreler ve 1 ml PBS ile yıkayın.
   2. Tamamen PBS çıkarın, 0.1 ml% 0.25 tripsin / 37 az 1 mM EDTA ve inkübe ° C 10 dakika ekleyin.
   3. ES orta 0.4 ml ekleyin ve tek hücre süspansiyonu için yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tarafından askıya.
   4. 6-plaka iyi bir hücre süspansiyonu Transfer, 1.5 ml ES hücre orta ekleyin ve 37 inkübe ° _C,% 5 CO2 inkübatör hücrelerin 6-kuyucuğu% 80-90 confluency ulaşana kadar. Bu noktada, aşağıdaki gibi hücreler dondurulmuş stok hazırlamak.
2. Dondurma stok hazırlanması
   1. Orta aspire hücreleri ve 2 ml PBS ile yıkayın.
   2. Tamamen PBS çıkarın, 0.5 ml% 0.25 tripsin / 37 az 1 mM EDTA ve inkübe ° C 10 dakika ekleyin.
   3. ES orta 2 ml ekleyin ve tek hücre süspansiyonu için yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tarafından askıya.
   4. 15 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu Transfer, hücrelerin sayısını ve hücrelerin aşağı döndürün.
   5. Süpernatantı atın ml başına 2x10 ⁶ hücre konsantrasyonu ES orta hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
   6. 2 ES hücre dondurma orta (ES orta% 20 DMSO) ve flakon başına 0.5 ml kısım hazırlayın.
   7. Şişeleri dondurma ve hafifçe karıştırın 0.5 ml hücre süspansiyonu aktarın.
   8. Bir hücre dondurma kabı koyun ve şişeleri ° C gecede -80 tutmak, uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı azot transfer.

Discussion

Bu video, Oct4-GFP/R26-M2rtTA ve Nanog-GFP/R26-M2rtTA fareler elde edilen MEFS GFP pozitif, pluripotent iPS hücreleri oluşturmak için bir indüklenebilir lentiviral sisteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu prosedür, yeniden programlama işlemi sırasında transgen ekspresyonu kontrolü sağlar çünkü iPS hücreleri üretmek için yararlı bir yöntemdir. IPS hücreleri nesil virüslerin kullanımı bir klinik ortamda bu hücrelerin kullanımını engellemektedir rağmen, bu prosedür henüz tanımlanan yeniden programlama sürecine altını önemli biyolojik sorulardan bazılarını yanıtlamak için etkinleştirin.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline hyclate	Reagent	Sigma-Aldrich	D9891-100G