Summary
Мы использовали синхротронное рентгеновской томографии в радиационной европейских синхротронного Facility (ESRF) для неинвазивного производить 3D-томографических данных с пиксель-разрешением 0.7μm. Используя программное обеспечение объема рендеринг, это позволяет реконструкция внутренних структур в их естественном состоянии без артефактов производства гистологических срезов.
Abstract
Мало что известно о внутренней организации многих микро-членистоногих с телом размером менее 1 мм. Причины, которые являются малые размеры и жесткие кутикулы, что затрудняет использование протоколов классической гистологии. Кроме того, гистологических срезов разрушает образец и поэтому не могут быть использованы для уникального материала. Таким образом, неразрушающий метод является желательным, который позволяет просматривать внутри небольших образцов без необходимости секционирования.
Мы использовали синхротронное рентгеновской томографии в радиационной европейских синхротронного Facility (ESRF) в Гренобле (Франция) для неинвазивного производить 3D-томографических данных с пиксель-разрешением 0.7μm. Используя программное обеспечение объема рендеринг, это позволяет нам реконструировать внутреннюю организацию в своем естественном состоянии, без артефактов производства гистологических срезов. Эти даты могут быть использованы для количественной морфологии, достопримечательностях, или для визуализации анимационных фильмов, чтобы понять структуру скрытые части тела и следовать за полные системы органов или тканей путем проб.
Protocol
Животных, используемых в данном исследовании
Образцы партеногенетических панцирных клещей Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) взяты из нашей лаборатории культуры. Культура растет на гипс / уголь смесь (9:1) в пластиковые банки, в постоянной темноте при 20-23 ° С около 90% влажности воздуха.
Пробоподготовка
- Образцы были взяты из культуры, чистить мягкой щеткой и помещен в 6:03:01 смесь 80% этанола, 35% формальдегида и 100%-ной уксусной кислотой в течение 24 часов.
- После этого образцы были обезвожены в серии градуированных этанола на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% с 3 изменений при каждой концентрации, и в 10 минутах между ступенями.
- Наконец, образцы помещались в пресной 100% этилового спирта в ночное время и критическая точка сушат в CO 2 (CPD 020, Balzers). Высушенные образцы были прикреплены к кончику пластмассовых штифта (1,2 см длиной, 3,0 мм в диаметре).
Синхротронное рентгеновской томографии
Рентгеновской томографии была выполнена в beamline ID19 (ESRF, Гренобль, Франция, эксперимент SC-2127).
- Образцы были установлены в стаканчик и доводили до центрального положения в пучке.
- Образцы были измерены с энергией 20,5 кэВ. Рентгенограммы были записаны с охлаждением ПЗС (ESRF Фрелон камеры) с 14-битным динамическим диапазоном, 2048 × 2048 пикселей и эффективный размер пикселя 0,7 мкм. 1500 прогнозы были зарегистрированы более 180 вращения образца ° с временем экспозиции 0,35 с для каждой проекции. Детектора к образцу расстояние 20 мм.
Использование определенного расстояния между образцом и детектором позволяет дифференциальных визуализации материалов с низкой рентгеновской коэффициентов затухания (Cloetens и соавт. 1996), который будет производить недостаточная контрастность изображения в поглощении (где образец расположен непосредственно перед детектором ). Большинство биологических вопросы фазовых объектов, состоящий из материалов с низким поглощения и / или только небольшие различия в атомный номер (Бец, и соавт. 2007). Однако, фаза расширенной томографии требует высокой пространственной когерентности однородного пучка рентгеновских лучей. Таким образом, синхротронное излучение лучше подходит, чем настольных сканеров для такого рода измерений.
Анализ данных
- В результате 2D рентгенограммы были преобразованы в 3D воксела данных (8-бит серого значений) с фильтром резервного проекции алгоритм (Cloetens и соавт., 1997)
- Воксела данные были проанализированы с помощью программного обеспечения VGStudio Макс 1.2.1. (Том Графика, Гейдельберг, Германия).
- Серый значения от фона были удалены из гистограммы для 3D-визуализации.
- Предустановленные камеры пути были использованы для создания вращательного анимации и анимационных плоскостей отсечения.
- Определяемые пользователем пути камеры была создана следовать пищеварительной системы А. longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации, мы сосредоточились на 3D-визуализации внутренней анатомии chelicerate микро-членистоногих. Синхротронного рентгеновского измерения позволяют пикселей разрешением до 0.3 мкм, в зависимости от размера выборки. Здесь мы показали данные с 0.7μm пикселей разрешение. Как правило, синхротронного рентгеновской томографии могут быть полезны для анализа малых биологических материалов (или ткани) с низкой рентгеновского поглощения. Пикселей, что почти достигает обычного светового микроскопа. Техника может быть применена к любому виду материал, для которого внутренняя организация представляет интерес и которые не должны быть уничтожены секционирования. Гистологические срезы, однако, имеет то преимущество, что ткани могут быть окрашены дифференцированно, что невозможно с рентгеновской томографии. Но здесь, различных серо-значения соответствуют тканей с разными рентгеновских затухание, и серо-распределения значений можно расширить с помощью количественных томографии фазы (holotomography;. Cloetens и др., 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). Техника синхротронного рентгеновской томографии необычайно ценной из-за следующих причин:
- пробоподготовки просто и ограничивается фиксации и сушки, не гистологических срезов необходимо
- Метод является неинвазивным: внутренняя организация образце можно наблюдать в естественном состоянии
- в результате данных могут быть проанализированы в любой желаемой ориентации, которая отличается от гистологических срезов, где разделы крепятся к одной ориентации.
Мы предлагаем рассмотреть эту технику, когда внутренние структуры в естественном состоянии небольших образцов или образцов, которые не должны быть уничтожены (например, окаменелости в янтаре или типа образцов) должны быть проанализированы. Конечно, эта методика не ограничивается биологическими материалами, но здесь она имеет большое преимущество благодаря возможности анализа материалов с Х-лучей, которые имеют низкую рентгеновского поглощения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Пааво Бергман, Майкл Ломанн, и Себастьян Schmelzle за их помощь в ESRF. Эта работа была поддержана европейскими радиационной синхротронного фонда проекта SC-2127 путем выделения пучкового времени.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
