Icke-invasiv 3D-visualisering med submikrona upplösning Använda Synchrotron-röntgen-tomografi

Summary

Vi använde synkrotron Röntgenstrålstomografi på europeisk Synchrotron (ESRF) till icke-invasivt producera 3D tomografiska dataset med en pixel-upplösning på 0.7μm. Använda programvara volym rendering ger detta återuppbyggnaden av interna strukturer i sitt naturliga tillstånd utan artefakter som produceras av histologisk snittning.

Abstract

Lite är känt om den interna organisationen för många mikro-leddjur med kroppen storlekar under 1 mm. Skälen till detta är den lilla storleken och den hårda nagelband, vilket gör det svårt att använda protokoll av klassisk histologi. Dessutom förstör histologisk snittning provet och kan därför inte användas för unika material. Därför är en icke-förstörande metod önskvärt vilket gör det möjligt att se insidan små prover utan behov av snittning.

Vi använde synkrotron Röntgenstrålstomografi på europeisk Synchrotron (ESRF) i Grenoble (Frankrike) till icke-invasivt producera 3D tomografiska dataset med en pixel-upplösning på 0.7μm. Använda programvara volym rendering, ger detta oss att rekonstruera den interna organisationen i sitt naturliga tillstånd utan artefakter som produceras av histologisk snittning. Dessa datum kan användas för kvantitativa morfologi, landmärken, eller för visualisering av animerade filmer för att förstå strukturen av dolda kroppsdelar och följa kompletta organsystem eller vävnader genom prover.

Protocol

Djur som används i denna studie

Exemplar av partenogenetiska oribatid kvalster Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) togs från vårt laboratorium kultur. Kulturen växer på en gips / kol blandning (9:1) i plast burkar, i konstant mörker vid 20-23 ° C med ca 90% av luftfuktighet.

Provberedning

1. Prover togs från kulturen, rengöras med en fin pensel och placeras i en 06:03:01 blandning av 80% etanol, 35% formaldehyd och 100% ättiksyra i 24 timmar.
2. Efteråt var prover uttorkad i en graderad etanol serie av 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% och 100% med 3 byten vid varje koncentration och 10 min mellan stegen.
3. Slutligen var prov i färska 100% etanol över natten och kritisk punkt torkas i CO ₂ (CPD 020, Balzers). Torkade exemplar var knutna till toppen av plast stift (1,2 cm lång, 3,0 mm i diameter).

Synkrotron Röntgenstrålstomografi

Röntgenstrålstomografi utfördes på beamline ID19 (ESRF, Grenoble, Frankrike, experimentera SC-2127).

1. Proverna var monterade i provhållaren och anpassas till en central plats i strålen.
2. Mättes med en energi på 20,5 keV. De röntgenbilder spelades in med en kyld CCD (ESRF FReLoN kamera) med en 14-bitars dynamik, 2048 x 2048 pixlar och en effektiv pixelstorlek på 0,7 ìm. 1500 prognoser registrerades över 180 ° prov rotation med en exponeringstid på 0,35 s för varje projektion. Detektorn till prov avståndet var 20 mm.

Använda ett visst avstånd mellan prov och detektor ger en differens avbildning av material med låg röntgen dämpning koefficienter (Cloetens, et al. 1996), vilket skulle ge tillräcklig kontrast i absorption bildbehandling (där provet ligger direkt framför detektorn ). De flesta biologiska frågor fas föremål, som består av material med låg absorption och / eller endast små skillnader i atomnumret (Betz, et al. 2007). Kräver dock fas förbättrad tomografi en hög rumslig sammanhållning av en homogen röntgen strålen. Därför är synkrotronljus passar bättre än en stationär skannrar för denna typ av mätningar.

Dataanalys

1. Den resulterande 2D röntgenbilder förvandlades till 3D Voxel uppgifter (8-bitars grå-värden) med en filtrerad back-projektion algoritm (Cloetens, et al., 1997)
2. Den Voxel data analyserades med programvaran VGStudio Max 1.2.1. (Volym Grafik, Heidelberg, Tyskland).
3. Grå-värden från bakgrunden togs bort från histogrammet för 3D-visualisering.
4. Fördefinierade kamera-vägar användes för att generera roterande animeringar och animerade flygplan klippning.
5. Ett användardefinierat kamera väg genererades följa matsmältningssystemet A. longisetosus.

Discussion

I denna presentation har vi fokuserat på 3D-visualisering av interna anatomi en chelicerate mikro-leddjur. Den synkrotron röntgen mätningar möjliggör en pixel-upplösning ner till 0.3μm, beroende på storleken av provet. Här har vi visat data med 0.7μm pixlars upplösning. Generellt kan synkrotron Röntgenstrålstomografi vara användbart för att analysera små biologiskt material (eller vävnader) med låg röntgen dämpning. Den pixlar når nästan som på vanliga ljusmikroskop. Tekniken kan tillämpas på alla typer av material för vilken den interna organisationen är av intresse och som inte får förstöras av sektionering. Histologisk snittning, men har fördelen att vävnaderna kan färgas differentiellt, vilket inte är möjligt med röntgen tomografi. Men här, olika grå-värden motsvarar vävnader med olika röntgen dämpning, och den grå-värdet distributionen kan utökas med hjälp av kvantitativa fasen tomografi (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). Tekniken att synkrotron Röntgenstrålstomografi är extra värdefullt på grund av följande skäl:

1. provberedning är lätt och begränsas till fixering och torkning, ingen histologisk snittning nödvändigt
2. Metoden är icke-invasiva: den interna organisationen av provet kan observeras i naturligt tillstånd
3. den resulterande datasetet kan analyseras i valfri riktning som skiljer sig från histologiska sektionering där avsnitten är fästa i en läggning.

Vi föreslår med tanke på denna teknik när den interna strukturer i naturligt tillstånd av små prover eller prover som inte får förstöras (t.ex. fossil i bärnsten eller typ-prov) ska analyseras. Naturligtvis är denna teknik inte är begränsat till biologiskt material, men här är det av största fördelen på grund av möjligheten att analysera material med röntgenstrålar som har låga röntgen dämpning.