Summary
We gebruikten synchrotron X-ray tomografie bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) naar niet-invasieve 3D tomografie datasets te produceren met een pixel-resolutie van 0.7μm. Met behulp van volume rendering software, dit maakt de reconstructie van de interne structuren in hun natuurlijke staat, zonder de artefacten die door histologische coupes.
Abstract
Er is weinig bekend over de interne organisatie van een groot aantal micro-arthropoden met het lichaam maten hieronder 1 mm. De redenen daarvoor zijn de geringe omvang en de harde cuticula waardoor het moeilijk te gebruiken protocollen van de klassieke histologie. Daarnaast, histologische coupes vernietigt het monster en kan dus niet worden gebruikt voor uniek materiaal. Vandaar dat een niet-destructieve methode is wenselijk dat het mogelijk maakt om in kleine voorbeelden te bekijken zonder de noodzaak van snijden.
We gebruikten synchrotron X-ray tomografie bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (Frankrijk) naar niet-invasieve 3D tomografie datasets te produceren met een pixel-resolutie van 0.7μm. Met behulp van volume rendering software, dit laat ons toe om de interne organisatie in zijn natuurlijke staat te reconstrueren zonder dat de artefacten die door histologische coupes. Deze datum kan worden gebruikt voor de kwantitatieve morfologie, monumenten of voor de visualisatie van geanimeerde filmpjes om de structuur van verborgen lichaamsdelen te begrijpen en aan te vullen orgaansystemen of weefsels te volgen via de monsters.
Protocol
Dieren die gebruikt worden in deze studie
Exemplaren van de parthenogenetische oribatid mijt Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) werden genomen van ons laboratorium cultuur. De cultuur groeit op een gips / houtskool mix (09:01) in plastic potjes, in constante donker bij 20-23 ° C met ongeveer 90% van de luchtvochtigheid.
Monstervoorbereiding
- Monsters werden genomen uit de cultuur, gereinigd met een fijn penseel en geplaatst in een 6:03:01 mengsel van 80% ethanol, 35% formaldehyde en 100% azijnzuur gedurende 24 uur.
- Daarna exemplaren werden gedehydrateerd in een ethanolreeks van 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% en 100% met drie veranderingen voor elke concentratie, en 10 minuten tussen de stappen.
- Ten slotte werden monsters die in verse 100% ethanol 's nachts en kritische punt gedroogd in CO 2 (CPD 020, Balzers). Gedroogde exemplaren werden vastgemaakt aan het uiteinde van de plastic pinnen (1,2 cm lang, 3,0 mm in diameter).
Synchrotron X-ray tomografie
X-ray tomografie werd uitgevoerd bij bundellijn ID19 (ESRF, Grenoble, Frankrijk, experiment SC-2127).
- De monsters werden gemonteerd in de monsterhouder en aangepast aan een centrale positie in de balk.
- Monsters werden gemeten met een energie van 20,5 keV. De röntgenfoto's werden opgenomen met een gekoelde CCD (ESRF Frelon camera) met een 14-bit dynamisch bereik, 2048 × 2048 pixels en een effectieve pixelgrootte van 0,7 micrometer. 1500 projecties werden opgenomen over de 180 ° rotatie van monster met een belichtingstijd van 0,35 s voor elke projectie. De detector-to-sample afstand was 20 mm.
Met behulp van een bepaalde afstand tussen monster en detector maakt een verschil in beeld brengen van materialen met een lage X-ray demping coëfficiënten (Cloetens, et al.. 1996), die onvoldoende contrast zou produceren in de opname beeldvorming (waar het monster direct is gelegen in de voorkant van de detector ). De meeste biologische zaken fase objecten, samengesteld uit materialen met een lage absorptie en / of slechts kleine verschillen in atoomnummer (Betz, et al. 2007).. Echter, fase verbeterde tomografie vereist een hoge ruimtelijke samenhang van een homogene X-stralen. Daarom is synchrotron straling beter geschikt dan desktop-scanners voor dit soort metingen.
Data-analyse
- De resulterende 2D röntgenfoto's werden omgezet naar 3D voxel data (8-bit grijs-waarden) met een gefilterde back-projectie algoritme (Cloetens, et al.., 1997)
- De voxel gegevens werden geanalyseerd met de software VGStudio Max 1.2.1. (Volume Graphics, Heidelberg, Duitsland).
- Grijs-waarden van de achtergrond werden verwijderd uit het histogram voor 3D-visualisatie.
- Vooraf gedefinieerde camera-paden werden gebruikt om rotatie-animaties en geanimeerde clipping planes te genereren.
- Een door de gebruiker gedefinieerde camera weg was gegenereerd om het spijsverteringsstelsel van A. te volgen longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie hebben we ons gericht op de 3D-visualisatie van de interne anatomie van een chelicerate micro-geleedpotigen. Het synchrotron X-ray metingen laten een pixel-resolutie van beneden naar 0.3μm, afhankelijk van de grootte van de steekproef. Hier hebben we laten zien data met 0.7μm pixel-resolutie. In het algemeen kan synchrotron X-ray tomografie nuttig zijn voor het analyseren van kleine biologische materialen (of weefsels) met een lage X-ray demping. De pixel resolutie bereikt bijna die van conventionele lichtmicroscopie. De techniek kan toegepast worden op elk soort materiaal waarvan de interne organisatie is van belang en die niet mogen worden vernietigd door het snijden. Histologische snijden, echter, heeft het voordeel dat de weefsels kunnen differentieel worden gekleurd, wat niet mogelijk is met X-ray tomografie. Maar hier, verschillende grijs-waarden komen overeen met weefsels met verschillende X-ray demping, en de grijze-waarde distributie kan worden uitgebreid met behulp van kwantitatieve fase tomografie (holotomography;. Cloetens et al., 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). De techniek van synchrotron X-ray tomografie is buitengewoon waardevol vanwege de volgende redenen:
- monstervoorbereiding is eenvoudig en beperkt tot fixatie en drogen, geen histologische coupes is het noodzakelijk
- de methode is niet-invasief: de interne organisatie van het monster kan worden waargenomen in natuurlijke staat
- de resulterende dataset geanalyseerd kan worden in elke gewenste richting die verschillend is van histologische coupes, waar de secties zijn bevestigd aan een oriëntatie.
We raden overweegt deze techniek wanneer de interne structuren in de natuurlijke staat van kleine monsters of van de monsters die niet mogen worden vernietigd (bijvoorbeeld fossielen in amber of type-exemplaren) moeten worden geanalyseerd. Natuurlijk is deze techniek niet beperkt tot biologische materialen, maar hier is het van het grootste voordeel als gevolg van de mogelijkheid om analyseren van materialen met X-stralen die lage X-ray demping hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Paavo Bergmann, Michael Laumann, en Sebastian Schmelzle voor hun hulp bij het ESRF. Dit werk werd ondersteund door de European Synchrotron Radiation Facility project SC-2127 via de toewijzing van de balk tijd.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
