Summary
השתמשנו synchrotron רנטגן טומוגרפיה במתקן האירופי קרינה Synchrotron (ESRF) אל הלא פולשני לייצר 3D מערכי נתונים טומוגרפית עם רזולוציה פיקסל של 0.7μm. באמצעות עיבוד תוכנה נפח, זה מאפשר את שיקום מבנים פנימיים במצב הטבעי שלהם, ללא חפצים המיוצר על ידי חתך היסטולוגית.
Abstract
מעט מאוד ידוע על הארגון הפנימי של מיקרו פרוקי רגליים רבים גדלים עם הגוף מתחת מ"מ 1. הסיבות לכך הן גודל קטן לציפורן קשה אשר מקשה על שימוש בפרוטוקולים של היסטולוגיה הקלאסית. בנוסף, חתך היסטולוגית הורס את המדגם ולכן יכול שלא לשמש חומר ייחודי. לפיכך, שיטה בלתי הרסניות רצוי המאפשרת להציג בתוך דגימות קטנות ללא צורך של חתך.
השתמשנו synchrotron רנטגן טומוגרפיה במתקן האירופי קרינה Synchrotron (ESRF) ב גרנובל (צרפת) אל הלא פולשני לייצר 3D מערכי נתונים טומוגרפית עם רזולוציה פיקסל של 0.7μm. באמצעות עיבוד תוכנה נפח, זה מאפשר לנו לשחזר את הארגון הפנימי במצבו הטבעי, ללא חפצים המיוצר על ידי חתך היסטולוגית. תאריך אלה יכולים לשמש מורפולוגיה, ציוני דרך כמותית, או ויזואליזציה של סרטי אנימציה להבין את המבנה של חלקי גוף מוסתרים לעקוב מערכות איברים להשלים או רקמות באמצעות דגימות.
Protocol
בעלי חיים המשמשים במחקר זה
דוגמאות של oribatid parthenogenetic קרדית Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) נלקחו מתרבות במעבדה שלנו. תרבות גדל על הטיח של פריז / לערבב פחם (09:01) בצנצנות פלסטיק, בחושך קבוע ב 20-23 מעלות צלזיוס עם כ 90% של לחות באוויר.
לדוגמא הכנה
- דגימות נלקחו מן התרבות, לנקות עם מברשת עדינה והושמו 06:03:01 תערובת של אתנול 80%, 35% ו פורמלדהיד חומצה אצטית 100% למשך 24 שעות.
- לאחר מכן, דגימות היו מיובש בסדרה אתנול ציון של 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ו 100% עם 3 שינויים בריכוז כל אחד, 10 דקות בין המדרגות.
- לבסוף, דגימות הונחו להצביע טרי אתנול 100% לילה וביקורתית מיובשים CO 2 (עלות 020, Balzers). דגימות יבשים צורפו קצה סיכות פלסטיק (1.2 ס"מ אורך, 3.0 מ"מ קוטר).
Synchrotron רנטגן טומוגרפיה
רנטגן טומוגרפיה בוצעה על ID19 beamline (ESRF, גרנובל, צרפת, הניסוי SC-2127).
- הדגימות רכוב בעל-המדגם מותאם למיקום מרכזי הקורה.
- דוגמאות נמדדו עם אנרגיה של 20.5 קאב. צילומי נרשמו עם CCD מקורר (ESRF FReLoN מצלמה) עם 14-bit בטווח דינאמי, 2048 × 2048 פיקסלים גודל פיקסל אפקטיבי של 0.7 מיקרומטר. תחזיות 1500 נרשמו על סיבוב מדגם 180 ° עם זמן חשיפה של 0.35 עבור כל הקרנה. המרחק גלאי ל-המדגם היה 20 מ"מ.
באמצעות מרחק מסוים בין מדגם גלאי מאפשרת הדמיה ההפרש של חומרים עם רנטגן מקדמי הנחתה נמוך (Cloetens, et al. 1996), אשר ייצרו ניגוד מספיק בתחום ההדמיה קליטה (שם המדגם נמצא ישירות מול הגלאי ). בנושאים ביולוגיים רוב האובייקטים שלב, מורכב מחומרים עם קליטה נמוכה ו / או רק הבדלים קטנים במספר אטומי (Betz, et al. 2007). עם זאת, בשלב משופרת טומוגרפיה דורש קוהרנטיות מרחבית גבוהה של קרן רנטגן הומוגנית. לכן, קרינה synchrotron מתאים יותר מסוג אלה של מדידות מאשר מחשב שולחני סורקים.
ניתוח נתונים
- צילומי 2D וכתוצאה מכך הפכו לנתונים 3D voxel (8-bit אפור ערכים) עם אלגוריתם back-הקרנת מסוננים (Cloetens, et al., 1997)
- הנתונים נותחו voxel עם VGStudio תוכנה מקס 1.2.1. (כרך גרפיקה, היידלברג, גרמניה).
- גריי ערכי מהרקע הוסרו ההיסטוגרמה להדמיה-3D.
- מוגדרים מראש המצלמה נתיבים שימשו כדי ליצור אנימציות הסיבוב ומטוסים גזיר אנימציה.
- נתיב המוגדרים על ידי המשתמש במצלמה נוצר לעקוב מערכת העיכול של א ' longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במצגת זו, התמקדנו להדמיה-3D של האנטומיה הפנימית של chelicerate מיקרו arthropod. X-ray מאפשרים מדידות synchrotron פיקסל ברזולוציה של עד 0.3μm, תלוי בגודל המדגם. הנה, הראינו נתונים עם 0.7μm פיקסל ברזולוציה. באופן כללי, synchrotron רנטגן טומוגרפיה יכולה להיות שימושית לניתוח חומרים ביולוגיים קטנים (או רקמות) עם הנחתה רנטגן נמוכה. פיקסלים ברזולוציה כמעט מגיע לזה של מיקרוסקופ אור רגיל. הטכניקה ניתן ליישם על כל סוג של חומר שבו הארגון הפנימי הוא עניין שאסור נהרסו על ידי חתך. חתך היסטולוגית, לעומת זאת, יש את היתרון הזה רקמות יכול להיות מוכתם דיפרנציאלי, דבר שאינו אפשרי עם טומוגרפיה רנטגן. אבל כאן, שונה אפור ערכים מתאימות רקמות עם הנחתה רנטגן שונים, וחלוקת אפור ערך ניתן להרחיב באמצעות טומוגרפיה שלב כמותי (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). הטכניקה של טומוגרפיה synchrotron קרני ה-X הוא בעל ערך יוצא דופן, בשל הסיבות הבאות:
- הכנת המדגם קל מוגבלת קיבעון וייבוש, ללא חתך היסטולוגית הכרחי
- השיטה היא פולשנית: הארגון הפנימי של המדגם ניתן להבחין במצבו הטבעי
- בסיס הנתונים וכתוצאה מכך ניתן לנתח בכיוון הרצוי כל השונה חתך היסטולוגית שבה סעיפים קבועים לכיוון אחד.
אנו ממליצים לשקול את הטכניקה הזו בכל פעם את המבנים הפנימיים המצב הטבעי של דגימות קטנות או דגימות שלא יש להשמיד (למשל, מאובנים ענבר או סוג דגימות) הם להיות מנותח. כמובן, שיטה זו אינה מוגבלת חומרים ביולוגיים, אבל כאן זה היתרון הגדול ביותר בשל האפשרות של ניתוח חומרים עם צילומי רנטגן אשר הנחתה נמוך רנטגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים פאבו ברגמן, מיכאל לאומן, וסבסטיאן Schmelzle על עזרתם בבית ESRF. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Synchrotron האירופי קרינה מתקן SC-2127 דרך הקצאת זמן הקורה.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
