Summary
हम यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF) में सिंक्रोटॉन टोमोग्राफी एक्स - रे का इस्तेमाल गैर invasively 0.7μm की पिक्सेल संकल्प के साथ 3 डी tomographic डेटासेट का उत्पादन करने के लिए. मात्रा प्रतिपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, इस histological सेक्शनिंग द्वारा उत्पादित कलाकृतियों के बिना अपनी प्राकृतिक अवस्था में आंतरिक संरचना के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है.
Abstract
लिटिल 1 मिमी से नीचे शरीर के आकार के साथ कई सूक्ष्म arthropods के आंतरिक संगठन के बारे में जाना जाता है. कारणों के लिए है कि छोटे आकार और हार्ड छल्ली जो शास्त्रीय ऊतक विज्ञान के प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए यह मुश्किल बनाता हैं. इसके अलावा, histological सेक्शनिंग नमूना नष्ट कर देता है और इसलिए इस्तेमाल किया जा सकता है अद्वितीय सामग्री के लिए नहीं है. इसलिए, एक गैर विनाशकारी विधि वांछनीय जो सेक्शनिंग की जरूरत के बिना छोटे नमूनों के अंदर देखने की अनुमति देता है.
हम यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF) में ग्रेनोबल (फ्रांस) में सिंक्रोटॉन एक्स - रे टोमोग्राफी गैर invasively 0.7μm की पिक्सेल संकल्प के साथ 3 डी tomographic डेटासेट उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया. मात्रा प्रतिपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह हमें histological सेक्शनिंग द्वारा उत्पादित कलाकृतियों के बिना अपनी प्राकृतिक अवस्था में आंतरिक संगठन के पुनर्निर्माण करने की अनुमति देता है. ये तारीख मात्रात्मक आकारिकी, स्थलों, या एनिमेटेड फिल्मों के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है छिपा शरीर के अंगों की संरचना को समझने के लिए और नमूने के माध्यम से पूरा अंग प्रणालियों या ऊतकों का पालन करें.
Protocol
इस अध्ययन में इस्तेमाल किया पशु
हमारी प्रयोगशाला संस्कृति से parthenogenetic oribatid घुन Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) के नमूने ले जाया गया. संस्कृति पेरिस / प्लास्टिक जार में चारकोल मिश्रण (09:01) के प्लास्टर पर बढ़ता है, 20-23 पर लगातार अंधेरे में डिग्री सेल्सियस हवा नमी का लगभग 90% के साथ.
नमूना तैयार
- नमूने संस्कृति से ले जाया गया, एक ठीक ब्रश के साथ साफ है और 80% इथेनॉल, 35% formaldehyde के 24 घंटे के लिए और 100% एसिटिक एसिड का एक मिश्रण 06:03:01 में रखा.
- बाद में, नमूनों 70% वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, और 3 प्रत्येक एकाग्रता में परिवर्तन, और कदम के बीच 10 मिनट के साथ 100% में निर्जलित थे.
- अंत में, नमूने ताजा 100% इथेनॉल रातोंरात और सीओ 2 में महत्वपूर्ण सूख बिंदु (020 CPD, Balzers) में रखा गया . सूखे नमूनों प्लास्टिक पिनों की टिप (, व्यास में 3.0 मिमी 1.2 सेमी लंबे) से जुड़े थे.
सिंक्रोट्रॉन एक्स - रे टोमोग्राफी
एक्स - रे टोमोग्राफी beamline ID19 (ESRF, ग्रेनोबल, फ्रांस, अनुसूचित जाति - प्रयोग २१२७) में प्रदर्शन किया गया था.
- नमूने नमूना धारक में घुड़सवार थे और बीम में एक केंद्रीय स्थान को समायोजित.
- नमूने 20.5 कीव के एक ऊर्जा के साथ मापा गया. रेडियोग्राफ़ एक 14 बिट गतिशील रेंज के साथ एक ठंडा सीसीडी (ESRF FReLoN कैमरा), 2048 × 2048 पिक्सल और 0.7 सुक्ष्ममापी के एक प्रभावी पिक्सेल आकार के साथ दर्ज किए गए. 1500 के अनुमानों 180 ° नमूना रोटेशन पर प्रत्येक प्रक्षेपण के लिए 0.35 एस के एक जोखिम समय के साथ दर्ज किए गए. डिटेक्टर नमूना दूरी 20 मिमी था.
नमूना और डिटेक्तार के बीच एक निश्चित दूरी का प्रयोग कम एक्स - रे क्षीणन गुणांक (Cloetens, एट अल 1996.) है, जो अवशोषण इमेजिंग में अपर्याप्त विपरीत उत्पादन (जहाँ नमूना डिटेक्टर के सामने सीधे में स्थित है के साथ सामग्री की एक अंतर इमेजिंग के लिए सक्षम बनाता है ). हाल जैविक मामलों चरण वस्तुओं, कम अवशोषण और / या केवल परमाणु संख्या में छोटे मतभेदों (Betz, एट अल 2007.) के साथ सामग्री से बना रहे हैं. हालांकि, चरण बढ़ाया टोमोग्राफी एक सजातीय एक्स - रे किरण का एक उच्च स्थानिक जुटना की आवश्यकता है. इसलिए, सिंक्रोटॉन विकिरण बेहतर माप के इन प्रकार के लिए डेस्कटॉप स्कैनर से अनुकूल है.
डेटा विश्लेषण
- परिणामस्वरूप 2D radiographs फ़िल्टर एल्गोरिथ्म वापस प्रक्षेपण (Cloetens, एट अल., 1997) के साथ 3D voxel डेटा (8 बिट ग्रे-मान) में तब्दील हो रहे थे
- voxel डेटा सॉफ्टवेयर VGStudio 1.2.1 मैक्स के साथ विश्लेषण किया गया. (वॉल्यूम ग्राफिक्स, हीडलबर्ग, जर्मनी).
- पृष्ठभूमि से ग्रे मूल्यों 3D दृश्य के लिए हिस्टोग्राम से हटा दिया गया.
- पूर्व निर्धारित कैमरा पथ घूर्णी एनिमेशन और एनिमेटेड कतरन विमानों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
- एक उपयोगकर्ता परिभाषित कैमरा पथ ए के पाचन तंत्र का पालन करने के लिए उत्पन्न किया गया longisetosus.
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Discussion
इस प्रस्तुति में, हम एक chelicerate सूक्ष्म सन्धिपाद के आंतरिक शरीर रचना विज्ञान के 3 डी दृश्य पर ध्यान केंद्रित. सिंक्रोटॉन एक्स - रे माप के पिक्सेल संकल्प की अनुमति नीचे 0.3μm, नमूने के आकार पर निर्भर करता है. यहाँ, हम 0.7μm पिक्सेल संकल्प के साथ डेटा से पता चला है. आम तौर पर, सिंक्रोटॉन एक्स - रे टोमोग्राफी कम क्षीणन एक्स - रे के साथ छोटे जैविक सामग्री (या ऊतकों) का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है. पिक्सेल संकल्प है कि पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लगभग तक पहुँचता है. तकनीक सामग्री की किसी भी तरह है, जिसके लिए आंतरिक संगठन ब्याज की है और जो सेक्शनिंग द्वारा नष्ट नहीं किया जा चाहिए के लिए लागू किया जा सकता है. Histological सेक्शनिंग, तथापि, लाभ है कि विभिन्न ऊतकों दाग जा सकता है, जो एक्स - रे टोमोग्राफी के साथ संभव नहीं है. लेकिन यहां अलग - ग्रे मूल्यों को अलग क्षीणन एक्स - रे के साथ ऊतकों को अनुरूप है, और वितरण ग्रे मूल्य मात्रात्मक चरण टोमोग्राफी का उपयोग का विस्तार किया जा सकता है है (. Holotomography; Cloetens एट अल, 1999; Heethoff और Cloetens, 2008). सिंक्रोटॉन एक्स - रे टोमोग्राफी की तकनीक निम्नलिखित कारणों की वजह से असाधारण मूल्यवान है:
- नमूना तैयारी निर्धारण और सुखाने के लिए आसान है और सीमित है, कोई histological सेक्शनिंग आवश्यक है
- गैर इनवेसिव विधि है: नमूने के आंतरिक संगठन प्राकृतिक अवस्था में देखा जा सकता है है
- परिणामस्वरूप डाटासेट जो जहां वर्गों एक उन्मुखीकरण के लिए तय कर रहे हैं histological सेक्शनिंग से अलग है किसी भी वांछित अभिविन्यास में विश्लेषण किया जा सकता है.
हम इस तकनीक पर विचार का सुझाव है जब भी छोटे नमूने या नमूने जो (उदाहरण के लिए, एम्बर या टाइप नमूनों में जीवाश्म) नष्ट नहीं किया जा चाहिए के प्राकृतिक राज्य में आंतरिक संरचना का विश्लेषण हो रहे हैं. बेशक, इस तकनीक जैविक सामग्री के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन यहाँ यह सबसे बड़ा लाभ के एक्स - रे, जो कम क्षीणन एक्स - रे के साथ सामग्री का विश्लेषण करने की संभावना की वजह से है.
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Acknowledgments
हम Paavo Bergmann, माइकल Laumann, और सेबस्टियन Schmelzle ESRF पर उनकी मदद के लिए धन्यवाद. यह काम यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा बीम समय के आवंटन के माध्यम से अनुसूचित जाति २१२७ परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
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- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
