Summary
我々は、非侵襲的に0.7μmのピクセル解像度での3D断層データセットを生成するために欧州放射光施設（ESRF）でシンクロトロンX線トモグラフィーを使用。ボリュームレンダリングソフトウェアを使用して、これは組織学的切片によって生成された人工物のない自然の状態で内部構造の再構築が可能になります。
Abstract
リトルは1 mm未満のボディサイズを持つ多くの微小節足動物の内部組織についてはほとんど知られていない。理由は、小さいサイズ、それが困難な古典的な組織学のプロトコルを使用するようになるハードキューティクルです。さらに、組織学的切片は、試料を破壊するため、ユニークな材料を使用することはできません。したがって、非破壊法では、切片の必要なしに小さな試料の内部に表示することができますどの望ましい。
我々は、非侵襲的に0.7μmのピクセル解像度での3D断層データセットを生成するためにグルノーブル（フランス）での欧州放射光施設（ESRF）でシンクロトロンX線トモグラフィーを使用。ボリュームレンダリングソフトウェアを使用して、これは、私たちは組織学的切片によって生成される人工物なしで自然な状態での内部組織を再構築することができます。これらの日付は、定量的な形態、ランドマーク、または隠された体の部分の構造を理解し、サンプルを通して完全な臓器の器官または組織に従うようにアニメーション映画の視覚化のために使用することができます。
Protocol
本研究で使用されている動物
単為生殖ササラダニダニArchegozetes longisetosus（ダニ目、ササラダニ亜）の標本は、我々の研究室の培養液から採取した。文化が20から23で一定の暗所で、パリ/プラスチック瓶で木炭の混合（9:1）の石膏で育つ℃の空気の湿度の約90％と。
サンプルの準備
- 検体は細かいブラシで洗浄し、24時間80％エタノール、35％ホルムアルデヒド、100％酢酸の6時03分01秒混合物に入れ、培養液から採取した。
- その後、標本は70％、75％、80％、85％、90％、95％、および各濃度で3の変更、および手順の間に10分で100％の段階的エタノールシリーズで脱水した。
- 最後に、サンプルは、CO 2（CPD 020、バルザース）で乾燥させ、新鮮な100％エタノールを一晩と臨界点に置かれた。乾燥標本はプラスチックのピンの先端（;直径は3.0 mm長1.2センチメートル）に添付された。
シンクロトロンX線断層撮影法
X線断層撮影法は、ビームラインID19（ESRF、グルノーブル、フランス、実験SC - 2127）で行った。
- サンプルはサンプルホルダーにマウントされており、ビームの中央の位置に調整した。
- 試料は20.5 keVのエネルギーで測定した。 X線写真は、14ビットのダイナミックレンジを持つ冷却CCD（ESRF FReLoNカメラ）、2048 × 2048ピクセルおよび0.7μmの有効画素サイズで記録した。 1500年予測は、それぞれの投影のための0.35秒の露光時間で180 °の試料回転を介して記録した。検出器から試料間距離は20 mmであった。
サンプルと検出器の間に一定の距離を使用すると、（サンプルは検出器の正面に配置されている場所吸収撮像で不十分なコントラストを生成するような低X線減衰係数（Cloetens、ら1996）、と素材の差のイメージングが可能）。ほとんどの生物学的な事項は、低吸収および/または原子番号のわずかな違い（ベッツ、ら、2007）を有する材料で構成される位相オブジェクト、です。しかし、位相強化断層撮影は、均質なX線ビームの高い空間的コヒーレンスが必要です。そのため、シンクロトロン放射は、より良い測定のこれらの種類のデスクトップスキャナよりも適しています。
データの分析
- 結果として得られる2次元X線写真は、フィルタリング逆投影アルゴリズム（Cloetens、ら、1997）で3次元ボクセルデータ（8ビットのグレー値）に形質転換した
- ボクセルデータは、ソフトウェアVGStudioマックス1.2.1で分析した。 （ボリュームグラフィックス、ハイデルベルク、ドイツ）。
- 背景から灰色の値は、3次元視覚化ヒストグラムから削除されました。
- あらかじめ定義されたカメラパスは、回転アニメーションとアニメーションのクリッピング平面を生成するために使用されていました。
- ユーザー定義のカメラパスは、Aの消化器系に従うように生成されlongisetosus。
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Discussion
本発表では、我々は鋏角を持つマイクロ節足動物の内部の解剖学的構造の3D可視化に焦点を当てた。シンクロトロンX線測定は、試料のサイズに応じて、0.3μmするのピクセル解像度をダウンできます。ここで、我々は、0.7μmピクセルの解像度を持つデータを示している。一般的に、シンクロトロンX線断層撮影法は、低X線の減衰をもつ小さな生物学的材料を（あるいは組織）の分析に役立ちます。ピクセル解像度は、ほぼ従来の光学顕微鏡のことに達する。テクニックは、内部組織が関係があるため、セクションなどによって破壊されてはならないその材料の任意の種類に適用することができます。組織学的切片は、しかし、組織をX線断層撮影法では不可能である、差動で染色することができるという利点があります。しかし、ここで、別のグレー値は異なるX線の減衰を持つ組織に対応し、グレー値の分布は、定量的な位相トモグラフィを使用して拡張することができます（holotomography;。Cloetensら、1999; Heethoff＆Cloetens、2008）。シンクロトロンX線トモグラフィーの手法は、次の理由により特別な価値があります。
- 試料調製が容易と固定し、乾燥に限られている、ない組織学的切片は必要ありません
- このメソッドは非侵襲的である：サンプルの内部組織は自然な状態で観察することができます
- 結果のデータセットは、セクションが1つの方向に固定されている組織学的切片は異なる任意の方向に分析することができます。
私たちは、小さなサンプルのまたは破壊されてはならないの試料の自然状態での内部構造（例えば、黄色またはタイプ標本の化石）が分析されるたびに、この手法を検討し示唆している。もちろん、この技術は生物学的材料に限定されるものではありませんが、ここでは、低X線の減衰を持つX線で物質を分析の可能性があるため、最大の利点である。
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Acknowledgments
我々は、ESRFで彼らの助けのためにパーヴォバーグマン、マイケルラウマン、そしてセバスチャンSchmelzleに感謝。この作品は、欧州放射光施設ビームタイムの配分を通じて、プロジェクトSC - 2127によってサポートされていました。
References
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