Summary
우리는 비 invasively 0.7μm의 픽셀 해상도와 3D 단층 데이터 세트를 생산하는 유럽 싱크로 트론 방사선 시설 (ESRF)에 싱크로 트론 X - 선 tomography를 사용했습니다. 볼륨 렌더링 소프트웨어를 사용하여이 histological sectioning 제작한 공예품없이 자연 상태에서 내부 구조의 재건 수 있습니다.
Abstract
리틀은 1mm 아래의 신체 크기와 많은 마이크로 arthropods의 내부 조직에 대한 알려져있다. 에 대한 이유는 작은 크기와 어려운 클래식 조직학의 프로토콜을 사용할 수 있습니다 하드 표피입니다. 또한, histological sectioning는 샘플을 파괴하기 때문에 독특한 소재에 대해 사용할 수 없습니다. 따라서 비파괴 방법 sectioning의 필요없이 작은 샘플 안에서 볼 수 있습니다하는 것이 바람직하다.
우리는 비 invasively 0.7μm의 픽셀 해상도와 3D 단층 데이터 세트를 생성 그르노블 (프랑스)의 유럽 싱크로 트론 방사선 시설 (ESRF)에 싱크로 트론 X - 선 tomography를 사용했습니다. 볼륨 렌더링 소프트웨어를 사용, 이것은 우리 histological sectioning 제작한 공예품없이 자연 상태에서 내부 조직을 재구성 할 수 있습니다. 이 날짜는 숨겨진 신체 부위의 구조를 이해하고 예제를 통해 전체 기관의 시스템이나 조직에 따라 정량 형태, 랜드마크, 또는 애니메이션 영화의 시각화를 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
이 연구에 사용된 동물
parthenogenetic oribatid 마이트 Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida)의 표본은 우리의 연구실 문화에서 찍은. 문화가 20-23에서 지속적인 어둠 속에서, 파리 / 플라스틱 항아리에 숯 믹스 (9시 1분)의 석고의 성장 ° C 공기 습도 약 90 %를.
샘플 준비
- 표본은 좋은 브러시로 청소하고 24 시간 동안 80 % 에탄올, 35 % 포름 알데히드 100 % 초산의 6시 3분 1초 혼합 배치, 문화에서 찍은.
- 그 후, 표본은 각 농도 3 변경하고, 단계 사이에 10 분있는 등급 에탄올 70 % 시리즈, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 100 %에 탈수있었습니다.
- 마지막으로 샘플은 CO 2의 건조 신선한 100 % 에탄올 하룻밤과 임계점 (CPD 020, Balzers)에 배치했다. 말린 표본는 플라스틱 핀이의 끝 (; 직경 3.0 mm 길이 1.2 ㎝)에 첨부했습니다.
싱크로 트론 X - 선 tomography
X - 선 tomography는 beamline ID19 (ESRF, 그르노블, 프랑스, 실험 SC - 2127)에서 수행되었다.
- 샘플은 샘플 홀더에 장착하고 빔의 중앙 위치로 조정되었습니다.
- 샘플은 20.5 케빈의 에너지를 측정했다. radiographs은 14 비트 다이나믹 레인지로 냉각 CCD (ESRF 프렐론 카메라), 2,048 × 2,048 픽셀과 0.7 μm의의 효과적인 픽셀 크기로 기록되었다. 1500 계획은 각 투영 0.35 s의 노출 시간과 180 ° 샘플 회전을 통해 기록했다. 검출기 - 투 - 샘플 거리가 20mm되었습니다.
샘플과 검출기 사이에 일정한 거리를 사용하면 (샘플은 검출기의 바로 앞에 위치 흡수 이미징에 충분한 대비를 생성 낮은 X - 선 감쇠 계수 (Cloetens, 외. 1996)과 재료의 차등 이미징을 가능하게 ). 대부분의 생물 학적 문제는 낮은 흡수 및 / 또는 원자 번호에만 작은 차이 (베츠, 외. 2007)과 재료의 구성 단계 개체입니다. 그러나, 위상 강화 tomography은 단일 X - 선 빔 높은 공간적 일관성이 필요합니다. 따라서, 싱크로 트론 방사는 더 나은 측정 이러한 종류의 데스크탑 스캐너보다 적합합니다.
데이터 분석
- 그 결과 2D radiographs은 필터링된 다시 프로젝션 알고리즘 (Cloetens, 외., 1997)와 3D voxel 데이터 (8 비트 회색 값)으로 변형되었다
- voxel 데이터는 소프트웨어 VGStudio 최대 1.2.1로 분석했다. (볼륨 그래픽, 하이 델베르크, 독일).
- 배경에서 그레이 - 값이 3D - 시각화에 대한 히스토그램에서 제거되었습니다.
- 사전 정의된 카메라 경로는 회전 애니메이션과 애니메이션 클리핑 비행기를 생성하는 데 사용되었습니다.
- 사용자 정의 카메라 경로 A.의 소화 시스템에 따라 생성되었습니다 longisetosus.
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Discussion
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 chelicerate 마이크로 arthropod의 내부 해부의 3D - 시각화에 초점을 맞추었습니다. 싱크로 트론 X - 선 측정은 샘플의 크기에 따라, 0.3μm로의 픽셀 해상도를 허용합니다. 여기, 우리는 픽셀 해상도 0.7μm 데이터를 표시합니다. 일반적으로, 싱크로 트론 X - 선 tomography 낮은 X - 선 감쇠와 함께 작은 생물 학적 물질 (또는 조직)를 분석하는 데 유용할 수 있습니다. 픽셀 해상도는 거의 전통적인 조명 현미경의 도달합니다. 이 기술은 내부 조직이 관심하는과 sectioning에 의해 파괴되지해야하는 자료의 종류에 적용할 수 있습니다. Histological sectioning 그러나, 조직은 X - 선 tomography 가능 아니지만 differentially 스테인드 수있다는 장점이 있습니다. 하지만 여기, 다른 회색 값이 서로 다른 X - 선 감쇠와 조직에 해당하며, 회색 값 분포는 양적 위상 tomography 사용하여 확장 가능한 (holotomography;. Cloetens 외, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). 싱크로 트론 X - 선 tomography의 기술로 인해 다음과 같은 이유로 특별한 가치가있다 :
- 샘플 준비가 간단하고 고정 및 건조 제한됩니다, 아무 histological sectioning 필요가 없습니다
- 방법은 비침습입니다 시료의 내부 조직은 자연 상태로 관찰할 수
- 결과 세트가 섹션 한 방향으로 고정되어 있습니다 histological sectioning 다른 어떤 원하는 방향으로 분석할 수 있습니다.
작은 샘플이나 (예 : 호박 또는 형식 - 표본의 화석) 파괴해서는 안 샘플 자연 상태에서 내부 구조 분석을 때마다 우리는이 기술을 고려하는 것이 좋습니다. 물론,이 기술은 생물 학적 물질에 국한되지 않고 있지만, 여기서는 가장 큰 이점의 낮은 X - 선 감쇠를 X - 레이와 자료를 분석의 가능성 때문입니다.
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Acknowledgments
우리는 ESRF에서 자신의 도움을 파보 누르 버그만, 마이클 라우먼, 그리고 세바스찬 Schmelzle 감사드립니다. 이 작품은 빔 시간의 배분을 통해 유럽 싱크로 트론 방사선 시설 사업 SC - 2127에 의해 지원되었다.
References
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