Summary
Hemos utilizado sincrotrón de rayos X de tomografía en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) de forma no invasiva producir conjuntos de datos 3D tomográfica con un píxel de resolución de 0.7μm. El uso de software volumen renderizado, lo que permite la reconstrucción de las estructuras internas en su estado natural, sin los artefactos producidos por el corte histológico.
Abstract
Poco se sabe sobre la organización interna de muchos micro-artrópodos con un tamaño corporal por debajo de 1 mm. Las razones por las que son el pequeño tamaño y la cutícula dura que hace difícil el uso de protocolos de la histología clásica. Además, el corte histológico destruye la muestra y no puede ser utilizado para material único. Por lo tanto, un método no destructivo, es deseable que permite ver el interior de pequeñas muestras sin necesidad de seccionar.
Hemos utilizado sincrotrón de rayos X de tomografía en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble (Francia) para producir de forma no invasiva por tomografía 3D conjuntos de datos con una resolución de píxel de 0.7μm. El uso de software volumen renderizado, lo que nos permite reconstruir la organización interna en su estado natural, sin los artefactos producidos por el corte histológico. Estas fecha se puede utilizar para la morfología cuantitativa, puntos de referencia o para la visualización de películas de animación para comprender la estructura de las partes del cuerpo oculto y seguir sistemas completos de órganos o tejidos a través de las muestras.
Protocol
Los animales utilizados en este estudio
Las muestras de los ácaros oribátidos partenogenética longisetosus Archegozetes (Acari, Oribatida) se tomaron de nuestros cultivos de laboratorio. La cultura crece en un yeso / mezcla de carbón (9:1) en frascos de plástico, en la oscuridad constante a 20-23 ° C, con aproximadamente el 90% de humedad relativa del aire.
Preparación de la muestra
- Las muestras fueron tomadas de la cultura, limpiar con un cepillo de cerdas finas y se colocan en una mezcla 06:03:01 de etanol al 80%, 35% de formaldehído y el 100% de ácido acético durante 24 horas.
- Posteriormente, las muestras se deshidrataron en una serie de etanol escalonadas al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% con tres cambios en cada concentración, y 10 minutos entre los pasos.
- Finalmente, las muestras se colocaron en el nuevo punto de etanol al 100% durante la noche y crítico seca en CO 2 (CPD 020, Balzers). Las muestras secas se adjunta a la punta de los pasadores de plástico (1,2 cm de largo, 3,0 mm de diámetro).
Sincrotrón de rayos X de tomografía
Tomografía de rayos X se realizó en la línea de luz ID19 (ESRF, Grenoble, Francia, el experimento de SC-2127).
- Las muestras fueron montadas en el portamuestras y se ajusta a una posición central en la viga.
- Las muestras se midieron con una energía de 20,5 keV. Las radiografías fueron grabados con un CCD enfriado (ESRF Frelon cámara) con un rango dinámico de 14 bits, 2048 × 2048 píxeles y un tamaño de píxel de 0,7 micras eficaz. 1500 las proyecciones se registraron más de la rotación de 180 ° de la muestra con un tiempo de exposición de 0,35 s para cada proyección. La distancia del detector a la muestra fue de 20 mm.
Utilizando una cierta distancia entre la muestra y el detector permite una imagen diferencial de los materiales con bajos coeficientes de atenuación de rayos X (Cloetens, et al. 1996), lo que produciría el contraste es insuficiente en las imágenes de absorción (en el ejemplo se encuentra directamente en frente del detector ). La mayoría de los asuntos biológicos son objetos de fase, compuesta de materiales con baja absorción y / o sólo pequeñas diferencias en el número atómico (Betz, et al. 2007). Sin embargo, la fase de tomografía axial requiere una alta coherencia espacial de un grupo homogéneo haz de rayos X. Por lo tanto, la radiación de sincrotrón es más adecuado que los escáneres de escritorio para este tipo de mediciones.
Análisis de los datos
- Las radiografías resultantes 2D a 3D se transformaron los datos de voxel (8-bit color gris-valores) con una retroproyección filtrada algoritmo (Cloetens, et al., 1997)
- Los datos voxel se analizaron con el software Max vgstudio 1.2.1. (Gráficos de volumen, Heidelberg, Alemania).
- Grey-los valores del fondo fueron retirados del histograma para la visualización 3D.
- Predefinido de cámara caminos fueron utilizados para generar animaciones de rotación y planos de animación de recorte.
- Definido por el usuario camino de la cámara se ha generado a seguir el sistema digestivo de A. longisetosus.
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Discussion
En esta presentación, nos centramos en la visualización en 3D de la anatomía interna de un chelicerate micro-artrópodos. El sincrotrón de rayos X de las mediciones de permitir que un pixel de resolución de hasta 0.3μm, dependiendo del tamaño de la muestra. En este caso, hemos demostrado con datos 0.7μm píxeles de resolución. Por lo general, de sincrotrón de rayos X de tomografía puede ser útil para el análisis de pequeños materiales biológicos (o tejidos) con rayos X de baja atenuación. Los píxeles de resolución casi alcanza la de microscopía de luz convencional. La técnica se puede aplicar a cualquier tipo de material para la organización interna es de interés y que no deben ser destruidos por el corte. Corte histológico, sin embargo, tiene la ventaja de que los tejidos se pueden teñir diferencialmente, lo que no es posible con rayos X de tomografía. Pero aquí, los diferentes valores de grises corresponden a los tejidos con diferentes rayos X de la atenuación, y la distribución de grises valor puede ser ampliado mediante tomografía fase cuantitativa (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff y Cloetens, 2008). La técnica de sincrotrón de rayos X de tomografía es extraordinario valor, debido a las siguientes razones:
- preparación de la muestra es fácil y se limita a la fijación y secado, corte histológico no es necesario
- el método no es invasivo: la organización interna de la muestra se puede observar en su estado natural
- el conjunto de datos resultante puede ser analizada en cualquier orientación, que es diferente de la corte histológico en las secciones están fijados a una orientación.
Se sugiere considerar esta técnica siempre que las estructuras internas en el estado natural de las muestras pequeñas o de las muestras que no deben ser destruidos (por ejemplo, los fósiles en ámbar o el tipo de muestras) se van a analizar. Por supuesto, esta técnica no se limita a los materiales biológicos, pero aquí es de la mayor ventaja debido a la posibilidad de analizar los materiales con los rayos X que tienen rayos X de baja atenuación.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Paavo Bergmann, Laumann Michael, y Schmelzle Sebastián por su ayuda en el ESRF. Este trabajo fue apoyado por el proyecto European Synchrotron Radiation Facility SC-2127 a través de la asignación del tiempo de haz.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
