Summary
עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.
Abstract
הגילוי של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) גדל באופן דרמטי את הכלים העומדים לרשות מדענים רפואיים מעוניין רפואה רגנרטיבית. עם זאת, הזרקה ישירה של hESCs, ותאי להבדיל hESCs, לתוך אורגניזמים חיים עד כה כבר הקשו על ידי מוות של תאים משמעותי, היווצרות תפלצת רוחנית, ודחייה מארח החיסונית. הבנת התנהגות hESC vivo לאחר ההשתלה דורש טכניקות הדמיה חדשנית longitudinally לפקח לוקליזציה hESC, שגשוג, ואת הכדאיות. הדמיה מולקולרית נתן החוקרים אמצעי תפוקה גבוהה, לא יקר, רגיש עבור מעקב התפשטות תאים vivo לאורך ימים, שבועות ואפילו חודשים. התקדמות זו גדל באופן משמעותי את הבנת במרחב ובזמן קינטיקה של engraftment hESC, התפשטות, תפלצת היווצרות בנושאים החיים.
התקדמות גדולה הדמיה מולקולרית כבר את הסיומת של מבחני גן פולשנית כתב ביולוגיה מולקולרית תאית לתוך in vivo מרובת פלטפורמות שיטת הדמיה. גנים אלו הכתב, בשליטת היזמים משפרי מהונדסים כי לנצל מכונות תעתיק של התא המארח, הם הציגו לתוך התאים באמצעות מגוון של שיטות וקטור וקטור לא. לאחר בתא, גנים הכתב יכול להיות גם עיבד constitutively או רק בתנאים ביולוגיים או הסלולר ספציפי, בהתאם לסוג של האמרגן בשימוש. תמלול ותרגום של גנים לחלבונים כתב ביו מזוהה אז עם מכשור, רגיש פולשנית (למשל, מצלמות CCD) באמצעות האות מניבות בדיקות כגון D-luciferin.
כדי למנוע את הצורך לעקוב אחר האור מעוררים בתאי גזע in vivo כפי שנדרש לצורך דימות פלואורסצנטי, כתב פליטת אור גן מערכות הדמיה דורשים רק בדיקה מנוהל exogenously לגרום פליטת האור. גחלילית בלוציפראז, נגזר Photinus גחלילית pyralis, מקודד אנזים המזרז D-luciferin על המטבוליט הפעיל אופטית, oxyluciferin. פעילות אופטית אז יכול להיות במעקב עם מצלמת CCD חיצוני. ביציבות transduced תאים שנושאים את הכתב לבנות בתוך הדנ"א בכרומוזומים שלהם יעבור הכתב לבנות DNA לתאי הבת, המאפשר ניטור האורך של הישרדות hESC ושגשוגם in vivo. יתר על כן, כי הביטוי של המוצר גן הכתב נדרש דור האות, קיימא רק בתאי אב ובתו תיצור אות פליטת אור; תאים אפופטוטיים מת או לא.
בסרטון הזה, החומרים הספציפיים הדרושים ריבוי שיטות מעקב בתאי גזע היווצרות תפלצת עם הדמיה פליטת אור יתוארו.
Protocol
- בנייה של ג'ין Fusion פעמיים Reporter
- כדי לבצע הדמיה של פליטת אור בתאי גזע עובריים אנושיים, תחילה עליך להשיג תאים ביציבות להביע גן הכתב בלוציפראז כגון בלוציפראז גחלילית מונע על ידי האמרגן מכוננת כמו היוביקוויטין או EF1a.
- ההתמקדות של פרוטוקול זה על יישומים גן הכתב, כך נהלים מפורטים לא ניתנים כאן. עם זאת, האסטרטגיה הכללית של המעבדה שלנו היא להשתמש היתוך כפול לבנות וקטור המכיל גחלילית בלוציפראז (fluc) משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (egfp) מופרדים על ידי spacer בתוך pCDNA 3.1 +.
- בקצרה, גן היתוך כפול שלנו נמצא במקור הזרם של האמרגן ציטומגלווירוס ב pCDNA 3.1 (+), כך בקטע 3.3 kbp היה נכרת באמצעות NdeI ו NotI העיכול סוף בוטה-ligated לתוך האתר שיבוט מרובות של SIN (עצמית inactivating ) וקטור lentiviral, תחת שליטה של מקדם יוביקוויטין.
- Lentiviral התמרה
- hESCs ניתן transduced 3-5 ימים לאחר מעבר על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 (כייל ויראלי של כ 107 מודגרות עם 106 תאים).
- המניה ויראלי מופשר ניתן להוסיף ישירות המדיה hESC טריים.
- רענן התקשורת 12 ו - 24 שעות לאחר מכן.
- לאחר 48 שעות, יעילות התמרה יכול להעריך על ידי איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, FACS ניתן להשתמש כדי לבודד תאים נגועים.
- Culturing hESCs ומבוא הדמיה הקמה
- תרבות hESCs חיובי בלוציפראז שלך מזין ללא תנאים. אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי WiCell ולהשתמש צלחות 6-היטב מצופה גורם גדילה מופחת Matrigel, או באמצעות אמצעי התקשורת מותנה או מסחריים, מזין ללא התקשורת.
- כדי לזהות את התאים חיובי בלוציפראז, תצטרך לקבל את הכתב בדיקה D-luciferin כבר מוכנה. כדי לעשות זאת luciferin, aliquot ב 1-1.5 ההכנות מ"ל בריכוז סופי של 45 מ"ג / מ"ל. שמור את aliquots ב -20 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש ולהימנע מחשיפה לאור על ידי כיסוי עם מגבת נייר כאשר לא אחסון.
- על מנת להמחיש את התאים חיובי בלוציפראז, אנו משתמשים IVIS 50 ו IVIS 200 מערכות דימות (Xenogen Corporation, Alameda, CA). מערכת זו האחרונה כוללת מנגנון isoflourane משולבת קאמרית אינדוקציה עבור הרדמה זמנית של חיות קטנות.
- בשנת הדמיה חוץ גופית של פליטת אור hESCs
- עבור הדמיה פליטת אור חוץ גופית, חשוב לשמור על תנאים סטריליים. לכן, מערכת הדמיה צריך להיות סטרילי, רצוי בחדר תרבית תאים.
- לפני הדמיה, הסר את המדיה התא להוסיף PBS מספיק כדי לכסות את התאים. לדוגמה, להוסיף 1mL PBS היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה תרבויות hESC שלך.
- יחס של D-Luciferin כדי PBS צריך להיות 1:100, אז להוסיף 10 μL של מופשר D-Luciferin היטב בכל צלחת 6-הבאר.
- המתן דקה אחת, ואז לקחת תמונה באמצעות זמן חשיפה של שנייה 1. אם האות חלש, להגדיל את מרווח החשיפה ונסה שוב.
- האות bioluminescent משקף מספר התא, כך מבחני quantitation יכול להתבצע המתואמים אות עם מספרים תאים שונים.
- הכנה של העכבר על הזרקת תאים in vivo הדמיה
- כתב הגן הדמיה מספק שיטה תפוקה גבוהה, זול רגיש עבור תאים המעקב לאחר ההשתלה על ימים, שבועות ואפילו חודשים. זה חשוב במיוחד מאז בתאי גזע מושתלים לעתים קרובות בצורת teratomas, נדחות על ידי המערכת החיסונית של המארח, או פשוט למות.
- השיטה הפשוטה ביותר ליצירת תפלצת הדמיה in vivo היא להזריק hESCs המבטאים את הגן כתב בלוציפראז גחלילית לתוך גבם של עכברים SCID ולרכוש תמונות bioluminescent עם מערכת IVIS.
- כאשר אתה מוכן להשתיל את התאים, או להשתמש dispase collagenase כדי לשחרר את התאים, לשטוף כמה פעמים, להשעות אותם בתערובת 01:01 של גורם הגדילה מופחתת matrigel ו DMEM. בדרך כלל אנחנו הראשונים לערבב את התאים DMEM מקורר ולאחר מכן להוסיף matrigel. עבור כל אתר הזרקה תת עורית, אנו מזריקים 200,000 תאים תלוי בנפח 50-100 ul תערובת matrigel / DMEM. מספר התא יכול להיות מותאם בהתאם ליישום שלך. זכור לשמור את הכל על קרח לפני הזריקה.
- לאחר התאים מוכנים, להרדים את העכבר על ידי הצבת אותו בתיבה אינדוקציה עם הזרם isoflurane מופעלת. אחרי 1-5 דקות, העכבר ישנה ניתן להציב על שולחן הניתוחים עם isoflurane רציפה.
- כי באופן טבעי הפרווה אוטומטי מאיר ועלול לטשטש את התמונה bioluminescent, נצטרך להסיר את השיער מן הצד האחורי של העכבר. הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא להשתמש במכונת גילוח חשמלית, אבל אתה יכול גם להשתמש להסרת שיער ג'ל. נגבו עם אלכוהול לעקראת העור לאחר מכן
- בשלב הבא, להכין מתלה הנייד שלך מזרק. 23-27 מחטים מד העבודה הטובה ביותר מאז הם לא סותמים עם תאים. אם המחט גדולה מדי (<23 מד) את דרכי מחט עלול להשאיר חור גדול שדרכו תאים יכול לדלוף החוצה.
- להזריק את התאים מתחת לעור לחלק האחורי של העכבר. בגלל העור רופף למדי, השתמש באגודל ובאצבע לצבוט ולמתוח את האזור אתה רוצה להזריק. להזריק מתחת לעור, נזהרת שלא לנקב עמוק מדי. כמו כן, מנסה לשמור את המחט מלהחליק מתוך הזריקה בזמן מדכא על הבוכנה: זה ימנע יצירת חור בעור שדרכו התאים יכול לדלוף אם תנסה להזריק שוב.
- אחרי התאים מוזרקים, לחכות כמה שעות כדי לאפשר העכבר להתעורר להתרוצץ מחדש לפני הרדמה הדמיה פליטת אור. פעולה זו נמנע רעילות isoflurane.
- פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של התאים המושתלים
- עבור הדמיה חיה כל פליטת אור, אנחנו עושים זריקה intraperitoneal של D-luciferin במשקל מ"ג / ק"ג 375 הגוף. לשקול את בעל החיים כדי לחשב את המינון לפני הזריקה.
- להזריק את D-luciferin ב הצפק, ממש ליד קו האמצע. להיזהר לא להיכנס עמוק מדי או שאתה יכול לגרום נזק לאיברים פנימיים. אם העכבר מתחיל להתעורר, מקום אותו בתיבה בנוקאאוט ולחכות דקה או שתיים. עבור עכברים, פליטת אור מקסימלית מתרחשת בדרך כלל 15-40 דקות לאחר ההזרקה.
- זכור למקום נייר שחור מט בתיבת הדמיה לעזור לקלוט את כל האור הנפלטת לא hESCs. מניחים את העכבר (עד הישבן) בחדר הדמיה עם isoflurane, על גבי נייר שחור. התחלה עם זמן חשיפה של 10 שניות. אם אות רווי, לנסות ולהקטין את זמן החשיפה, אם חלש מדי, להגדיל את החשיפה.
- לאחר זמן חשיפה האות עבר אופטימיזציה עבור העכבר, להתחיל לקחת תמונות מכל רגע עד האות מגיע לשיא. הדבר נעשה כמיטב באמצעות תוכנת הדמיה כדי לבחור "אזורים של עניין (ROI)" כי לכסות אתרי הזרקה שלך. על ידי ניטור עוצמת האות בכל ROI כל אתה יכול בקלות לקבוע מתי האות מתחילה ירידה, המציין את עוצמת האות המקסימלי הושג. אות המקסימלי צריך לשמש הנתונים הסופיים שלך.
- כאשר אתה מרוצה עם התמונות שלך, הסר את העכבר מן isoflurane ולאפשר לו להתעורר בכלוב שלה. בדרך כלל, העכבר צריך להתעורר תוך 15 דקות.
- כתב פליטת אור הדמיה הגן ניתן לחזור על בסיס יומי, שבועי וחודשי ככל hESCs לשרוד החיה. אותות מן תפלצת רוחנית מתפתחת יגדל אקספוננציאלית לאורך זמן, בדרך כלל בסדר גודל של שבועות, כפי hESCs מתחילים להתרבות.
- לאחר הקורס הזמן הרצוי של תמונות פליטת אור נרכש, בעלי חיים עשוי להיות קורבן וקטעי רקמה המשמש היסטולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לעומת שיטות אחרות כגון PET ו-MRI, פליטת אור בעל רזולוציה מרחבית מוגבלת חדירה לרקמות מופחת בשל האנרגיה חלשה יחסית של פוטונים הנפלטים (2-3 eV); מסיבות אלה יש עד כה לא היה רלוונטי בחיות גדולות. עם זאת, פליטת אור יש את היתרון של להיות בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה, ולא פולשנית, מה שהופך אותו רצוי מאוד עבור תא גזע vivo מעקב אצל בעלי חיים קטנים. ללא פליטת אור גנים הכתב כגון בונה PET ו פלואורסצנציה ניתן להשתמש בשילוב עם בלוציפראז ליצור לכתב היתוך הגן מורכב תחומים שונים המכילים את הגנים כתב בודדים. לדוגמה, הקבוצה שלנו משתמשת היתוך מבנה המכיל fluc, monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mrfp), ואת וירוס הרפס סימפלקס מקוצץ thymidine קינאז (ttk, גן הכתב PET) למעקב אחר אפנות רב של התנהגות בתאי גזע של בעלי חיים קטנים. במשך הזמן, גנים משולבים כתב ביציבות עשוי להיות כפוף להשתקת גנים באמצעות המנגנון כרומוזומליות אנדוגני. הרגישות הגן של הכתב כדי השתקת הגן קשורה קשר הדוק הבחירה של האמרגן נהיגה הביטוי שלה. למשל, האמרגן ציטומגלווירוס (pCMV) מושתק במהירות hESCs. במעבדה שלנו יש לו הצלחה טובים עם האמרגן היוביקוויטין-C האנושי (ערווה) לנהוג ביטוי היתוך כפול לבנות שורות תאים מרובים hESC, יש לצפות אובדן האות מינימלית לאורך זמן.
לסיכום, לפני hESC הנגזרות התחדשות התאים הופך להיות רלוונטיות קלינית, כמה מכשולים ביולוגיים בסיסיים שיש להתגבר עליו - כלומר מוות של תאים או אפופטוזיס לאחר השתלה של תאים מובחנים, היווצרות תפלצת רוחנית מתוך תאים שלא עברו התמיינות, וכן דחייה של מערכת החיסון על ידי האורגניזם המארח. אתגרים אלה ואחרים מדגישים את הצורך engraftment hESC מעקב, הישרדות, ועל התפשטות בתוך האורגניזם המקבל. פיתוח טכניקות הדמיה מולקולרית כגון הגן גחלילית בלוציפראז הכתב אולטרה רגיש מצלמות CCD איפשר פולשני, הערכה חוזרת ונשנית של מיקום התא, הגירה, שגשוג, והבחנה in vivo. טכנולוגיות כגון אלו יעזרו תרגום לדחוף הביולוגיה hESC מהמעבדה לכיוון יישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
הודות טים דויל, PhD והמרכז סטנפורד בתחום ההדמיה Vivo לסיוע עם הדמיה פליטת אור. כמו כן, הודות Ngan הואנג, PhD לשיתוף הטכניקה שלה על תא גזע שיתוף זריקה עם פתרון מטריקס. לבסוף, בזכות סטיב לבד, Ph.D. לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים וטרינרי.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
