Summary
Med det växande intresset för stamcellsbehandlingar, molecular imaging tekniker är idealiska för övervakning av stamcellstransplantation beteende efter transplantationen. Luciferas reporter gener har aktiverat icke-invasiva, repetitiva bedömning av cellens överlevnad, placering och spridning i vivo. Denna video kommer att visa hur du spårar hESC spridning i en levande mus.
Abstract
Upptäckten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) har ökat dramatiskt de verktyg som finns för att medicinska forskare intresserade av regenerativ medicin. Dock har direktinsprutning av hESCs, och celler skiljas från hESCs, i levande organismer hittills hämmats av betydande celldöd, teratom bildning, och värd avstötning. Förstå in vivo hESC beteende efter transplantation kräver nya avbildningstekniker för att longitudinellt följa hESC lokalisering, spridning och överlevnad. Molekylär avbildning har gett utredare en hög genomströmning, billig och känsliga metoder för att spåra in vivo celltillväxt under dagar, veckor och även månader. Denna utveckling har avsevärt ökat förståelsen för tid och rum kinetik hESC engraft, proliferation och teratom-formation i levande individer.
Ett stort framsteg inom molekylär bildanalys har varit en förlängning av icke-invasiv analyser reporter gen från molekylär-och cellbiologi till in vivo multimodalitet bildbehandling plattformar. Dessa reporter gener, under kontroll av tekniska medel och medel som utnyttjar värdcellens s transkriptionell maskiner införs i celler med hjälp av olika vektor och icke-vektor metoder. Väl inne i cellen, kan reporter gener transkriberas antingen konstitutivt eller endast under särskilda biologiska eller cellulära villkor, beroende på vilken typ av promotor. Transkription och översättning av reporter gener i bioaktiva proteiner sedan detekteras med känslig, icke-invasiv instrumentering (t ex CCD-kameror) med hjälp av signal-genererande sonder som D-luciferin.
För att undvika behovet av excitatoriska lätta att spåra stamceller in vivo som krävs för fluorescens avbildning, mareld reporter gen bildsystem behöver endast en exogent administrerad sond för att framkalla ljus utsläpp. Firefly luciferas, som härrör från eldfluga Photinus pyralis, kodar ett enzym som katalyserar D-luciferin till optiskt aktiva metabolit, oxyluciferin. Optisk aktivitet kan sedan följas upp med en extern CCD-kamera. Stabilt transduced celler som bär reportern bygger på deras kromosomalt DNA kommer att passera reportern konstruera DNA till dotter celler, vilket möjliggör longitudinell övervakning av hESC överlevnad och spridning in vivo. Dessutom, eftersom uttrycket av reportern genprodukten krävs för signal generation, kommer bara livskraftiga förälder och dotter celler skapa mareld signal; apoptotiska eller döda celler kommer inte.
I denna video kommer de särskilda material och metoder som behövs för att spåra stamceller spridning och teratom formation med mareld avbildning beskrivas.
Protocol
- Konstruktion av Double Fusion Reporter Gene
- För att kunna utföra mareld avbildning av mänskliga embryonala stamceller måste du först få celler som stabilt uttrycka en luciferas reporter gen som eldfluga luciferas drivs av en konstitutiv promotor som Ubiquitin eller EF1a.
- Fokus i detta protokoll är på tillämpningar reporter gen, så detaljerade förfaranden inte tillhandahålls här. Men vår labb övergripande strategi att använda en dubbel vektor fusion konstruktion som innehåller eldfluga luciferas (fluktuationer) och förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) åtskilda av en spacer inom pCDNA 3,1 +.
- Kort sagt, var vår dubbla fusion gen ursprungligen belägen nedströms cytomegalovirus promotor i pCDNA 3,1 (+), så 3,3 KBP fragmentet var censurerade med NdeI och Noti matsmältningen och trubbig slut knyts ihop i flera kloning platsen för en själv inaktivera (SIN ) Lentiviral vektor, under kontroll av en Ubiquitin promotor.
- Lentiviral Transduction
- hESCs kan transduced 3-5 dagar efter passagen på en mångfald av infektion (MOI) av 10 (virala titer på cirka 107 inkuberas med 106 celler).
- Den upptinade virus lager kan läggas direkt till frisk hESC medier.
- Uppdatera media 12 och 24 timmar senare.
- Efter 48 timmar kan transduktion effektiviteten genom kvalitativt utvärderas med hjälp av fluorescensmikroskopi. Därefter kan FACS användas för att isolera infekterade celler.
- Odling hESCs och introduktion till bildbehandling Set-up
- Kultur din luciferas positiva hESCs i feeder-fria förhållanden. Vi följer vanligtvis standard WiCell-protokollet och använder 6-brunnars plattor överdragna med tillväxtfaktor minskad Matrigel, antingen betingad media eller kommersiella, feeder-fria medier.
- Att upptäcka luciferas positiva celler, måste du ha reporter sond D-luciferin redan förberett. För att göra detta, alikvot luciferin i 1-1,5 ml förberedelser på en slutlig koncentration på 45 mg / ml. Håll alikvoter vid -20 ° C när den inte används och undvika exponering för ljus genom att täcka med pappersduk när de inte i lager.
- För att visualisera luciferas positiva celler, använder vi IVIS 50 och IVIS 200 Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, Kalifornien). Det senare systemet omfattar en integrerad isoflourane apparater och induktionskammare för tillfällig bedövning av små djur.
- In vitro bioluminescence avbildning av hESCs
- För in vitro-bioluminescens avbildning, är det viktigt att bibehålla sterila förhållanden. Därför bör Imaging System vara sterila, helst i en cellkultur rum.
- Innan avbildning, ta bort cellen media och lägga lagom PBS för att täcka cellerna. Till exempel Tillsätt 1 mL PBS i varje brunn på en 6-brunnar innehåller din hESC kulturer.
- Förhållandet mellan D-luciferin till PBS bör 1:100, så lägg till 10 mikroliter av den upptinade D-luciferin till varje brunn på 6-brunnar.
- Vänta en minut, sedan ta en bild med en exponeringstid på 1 sekund. Om signalen är svag, öka exponeringen intervall och försök igen.
- Den självlysande signalen speglar mobilnummer, så kvantifiering analyser kan utföras som korrelerar signalen med olika cell nummer.
- Beredning av mus och injicera celler för in vivo imaging
- Reporter gen bildbehandling ger en hög genomströmning, billig och känslig metod för att spåra celler efter transplantation över dagar, veckor och även månader. Detta är särskilt viktigt eftersom transplanterade stamceller ofta utgör teratom, avslås av värdens immunsystem, eller helt enkelt dö.
- Den enklaste metoden för avbildning teratom bildas in vivo är att injicera hESCs som uttrycker den eldfluga luciferas reporter gen i ryggen på SCID möss och skaffa självlysande bilder med IVIS systemet.
- När du är redo att transplantera celler, använder dispase eller kollagenas att lossa cellerna, tvätta flera gånger, och avbryta dem i en 1:1 blandning av tillväxtfaktor reducerat matrigel och DMEM. Typiskt vi blandar först cellerna med kylda DMEM och sedan lägga i matrigel. För varje subkutan injektionsstället, injicera vi 200 tusen celler upphängd i ett 50-100 ul volym matrigel / DMEM blandning. Cellen Antalet kan justeras beroende på din ansökan. Kom ihåg att hålla allt på is före injektion.
- När cellerna är redo, söva musen genom att placera den i induktion låda med isofluran flöde påslagen. Efter 1-5 minuter är musen sover och kan placeras på operationsbordet med kontinuerlig isofluran.
- Eftersom päls naturligt automatisk fluorescerar och kan maskera det självlysande bilden, kommer vi att behöva ta bort hår från baksidan av musen. Det enklaste sättet att göra detta är att använda en elektrisk rakapparat, men du kan även använda hår-borttagning geler. Torka med alkohol för att steriliserahuden efteråt
- Nästa, dra upp din cellsuspension i en spruta. 23 till 27 gauge nålar fungerar bäst eftersom de inte kommer att täppa upp med celler. Om nålen är för stor (<23 gauge) nålen tarmkanalen kan lämna ett stort hål genom vilken cellerna kan läcka tillbaka ut.
- Injicera cellerna under huden i musen rygg. Eftersom huden är ganska lös, använd tummen och pekfingret för att nypa och sträcka ut det område du vill injicera. Injicera under huden, se till att inte punktera alltför djupt. Försök också att hålla nålen glider ut från injektionsstället och samtidigt trycka in kolven: Detta kommer att förhindra att skapa ett hål i huden genom vilken cellerna kan läcka om du försöker injicera igen.
- Efter att cellerna injiceras, vänta ett par timmar så att musen för att vakna upp och springa runt innan de anesthetizing för bioluminescens avbildning. Om du gör det undviker isofluran toxicitet.
- In vivo bioluminescence avbildning av transplanterade cellerna
- För hela djuret mareld bildbehandling, gör vi en intraperitoneal injektion av D-luciferin på 375 mg / kg kroppsvikt. Väg djuret för att beräkna doseringen före injektion.
- Injicera D-luciferin i bukhinnan, strax utanför mittlinjen. Var noga med att inte gå för djupt eller du kan skada inre organ. Om musen börjar vakna upp, lägg tillbaka den i knockout boxen och vänta en minut eller två. För möss, uppstår den maximala mareld vanligen 15-40 minuter efter injektionen.
- Kom ihåg att placera matt svart papper i bildbehandling rutan för att hjälpa absorbera ljuset inte avges av hESCs. Placera musen (baksidan upp) i avbildning kammare med isofluran, på toppen av svart papper. Börja med en exponeringstid på 10 sekunder. Om signalen är mättad, försöka minska exponeringstiden, om för svag, öka exponeringen.
- När signalen exponeringstiden har optimerats för musen, börja ta bilder varje minut tills signalen når sitt maximum. Detta görs bäst genom att använda bildprogram att välja "områden av intresse (ROI)" som döljer dina injektionsställen. Genom att övervaka signalstyrkan på varje ROI kan du enkelt avgöra när signalen börjar minska, vilket visar att den maximala signalstyrkan har uppnåtts. Den maximala signalen bör användas som din slutliga data.
- När du är nöjd med dina bilder, ta bort musen från isofluran och låta den vakna upp i sin bur. Vanligtvis ska musen vaknar inom 15 minuter.
- Bioluminescence reporter gen avbildning kan upprepas dagligen, veckovis och månadsvis så länge de hESCs överleva i djuret. Signal från ett utvecklingsland teratoma kommer att öka exponentiellt med tiden, oftast i storleksordningen veckor, eftersom hESCs börjar föröka sig.
- Efter önskad tid under bioluminescens bilder förvärvas, kan djuret offras och vävnadssnitt används för histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med andra metoder såsom PET och MRI, har bioluminescens begränsad rumslig upplösning och minskat in i vävnaderna på grund av den relativt svaga energin som avges fotoner (2-3 eV), av dessa skäl har det hittills inte varit tillämplig i stora djur. Har dock bioluminescens fördelen att vara låg kostnad, hög genomströmning, och icke-invasiv, vilket gör det mycket önskvärt för in vivo stamceller spårning i små djur. Icke-bioluminescence reporter gener som PET och fluorescens konstruktioner kan användas tillsammans med luciferas för att skapa en gen fusion reporter som består av olika domäner som innehåller den enskilde reportern gener. Till exempel använder vår grupp en fusion konstruktion som innehåller fluktuationer, monomera rött fluorescerande protein (mrfp) och herpes simplex virus trunkerad tymidinkinas (TTK, en PET-reporter gen) för multimodalitet spårning av stamceller beteende hos små djur. Med tiden kan stabilt integrerad reporter generna vara föremål för utsläckning av geners uttryck med den endogena kromosomala maskiner. En reporter gen mottaglighet för geners uttryck hänger nära samman med valet av promotorn kör sitt uttryck. Till exempel är cytomegalovirus promotor (pCMV) snabbt tystas i hESCs. Vårt lab har haft god framgång med det mänskliga ubiquitin-C promotor (köns) för att driva uttryck för en dubbel fusion konstruktion i flera rader hESC cell och har observerat minimal signalförlust över tiden.
Sammanfattningsvis innan hESC-derived cellförnyelsen blir kliniskt relevant, måste flera grundläggande biologiska hinder att övervinna - nämligen celldöd eller apoptos efter transplantation av differentierade celler, teratom formation från odifferentierade celler, och avstötning av värdorganismen. Dessa och andra utmaningar belyser behovet för att spåra hESC engraft, överlevnad och spridning inom den mottagande organismen. Utvecklingen av molecular imaging tekniker såsom Firefly luciferas reporter gen och ultra-känsliga CCD-kameror har gjort att icke-invasiva, repetitiva bedömning av cellens läge, migration, proliferation och differentiering in vivo. Sådan teknik kommer att hjälpa driva översättning av hESC biologi från labbet mot kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Tack vare Tim Doyle, PhD och Stanford Center for in vivo imaging för hjälp med bioluminescens avbildning. Tack även till Ngan Huang, PhD för att dela sin teknik på stamceller samarbete injektion med matris lösning. Slutligen Felt tack vare Steve, Ph.D. för hjälp med veterinär djurvård.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
