Summary
مع تزايد الاهتمام في علاجات الخلايا الجذعية ، وتقنيات التصوير الجزيئي مثالية لمراقبة سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع. وقد مكنت الجينات مراسل Luciferase غير الغازية ، وتقييم المتكررة لبقاء الخلية ، والموقع ، وانتشارها في الجسم الحي. وهذا الفيديو لشرح كيفية تعقب انتشار hESC في ماوس المعيشة.
Abstract
وزاد اكتشاف الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل كبير من الأدوات المتاحة لعلماء الطب المهتمين في مجال الطب التجديدي. ومع ذلك ، الحقن المباشر للhESCs ، وخلايا متباينة من hESCs ، في الكائنات الحية وقد تم حتى الآن يعوقها موت الخلايا كبيرة ، وتشكيل مسخي ، ورفض استضافة المناعي. فهم في السلوك hESC المجراة بعد زرع يتطلب تقنيات التصوير الرواية لرصد توطين hESC طوليا ، والانتشار ، وقدرتها على البقاء. وقد أعطى المحققين التصوير الجزيئي وسيلة عالية الإنتاجية ، وغير مكلفة ، وحساسة لتعقب انتشار الخلايا في الجسم الحي خلال الأيام والأسابيع وحتى أشهر. وقد زاد هذا التقدم بشكل كبير في فهم حركية المكانية والزمانية لمن engraftment hESC ، والانتشار ، وتشكيل مسخي ، في الموضوعات الحية.
وثمة تقدم كبير في مجال التصوير الجزيئي على تمديد موسع فحوصات الجينات مراسل من البيولوجيا الجزيئية والخلوية في التصوير منصات متعددة في الجسم الحي الطريقة. هذه الجينات المراسل ، تحت سيطرة المروجين وهندستها القدرة على أن الاستفادة من آلية الخلية المضيفة ليالي النسخي ، يتم إدخالها في الخلايا باستخدام مجموعة متنوعة من أساليب ناقلات وغير الموجه. مرة واحدة في الخلية ، ويمكن جينات كتب مراسل constitutively إما أو فقط تحت ظروف محددة أو البيولوجية الخلوية ، اعتمادا على نوع من المروج المستخدمة. ثم يتم الكشف عن النسخ والترجمة من الجينات إلى بروتينات مراسل النشطة بيولوجيا مع الأجهزة وحساسة موسع (مثل كاميرات CCD) باستخدام إشارة المولدة للتحقيقات مثل مد luciferin.
لتجنب الحاجة للضوء مثير لتعقب الخلايا الجذعية في الجسم الحي كما هو مطلوب من أجل التصوير مضان ، تلألؤ بيولوجي نظم التصوير الصحفي الجين تتطلب تحقيقا خارجيا فقط تدار للحث على انبعاث الضوء. يراعة luciferase ، المستمدة من البرالس Photinus يراعة ، وهو الانزيم الذي يقوم بترميز يحفز D - luciferin إلى oxyluciferin ، المستقلب نشطة ضوئيا. ويمكن عندئذ أن تراقب النشاط البصري مع كاميرا CCD الخارجية. transduced ستابلي الخلايا التي تحمل الحمض النووي داخل مراسل بناء على الكروموسومات سيمر مراسل بناء الحمض النووي للخلايا ابنته ، والسماح لرصد الطولي للبقاء والانتشار hESC في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، لأنه مطلوب للتعبير مراسل الجين المنتج لتوليد الإشارات ، وقابلة للحياة الوالد وابنته الوحيدة الخلايا إنشاء إشارة تلألؤ بيولوجي ؛ الخلايا أفكارك أو ميتا لن.
في هذا الفيديو ، سيتم وصف المواد والأساليب المحددة اللازمة لتعقب وقف تكاثر الخلايا وتكوين مسخي مع التصوير تلألؤ بيولوجي.
Protocol
- بناء مزدوج فيوجن مراسل جين
- من أجل أداء التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، تحتاج أولا للحصول على الخلايا التي تعبر عن الجين ستابلي مراسل luciferase مثل يراعة luciferase يقودها المروج التأسيسية مثل اليوبيكويتين أو EF1a.
- ويركز هذا البروتوكول على تطبيقات مراسل الجينات ، لذلك لا يتم توفير إجراءات مفصلة هنا. ومع ذلك ، والاستراتيجية العامة مختبرنا هو استخدام بناء ناقلات مزدوجة الانصهار الذي يحتوي على يراعة luciferase (fluc) وتعزيز الخضراء بروتين فلوري (egfp) مفصولة هل ضمن pCDNA 3.1 +.
- باختصار ، كان لدينا الجينات الموجودة أصلا الانصهار مزدوجة المصب من المروج المضخم للخلايا في pCDNA 3.1 (+) ، لذلك تم رفعه جزء KBP 3.3 باستخدام NdeI NOTI والهضم وكليلة نهاية ligated في موقع استنساخ متعددة من الخطيئة (تعطيل الذاتي ) ناقلات lentiviral ، تحت سيطرة أحد المروجين اليوبيكويتين.
- Lentiviral تنبيغ
- يمكن hESCs transduced 3-5 أيام بعد مرور في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 (من 107 عيار الفيروسي حوالي 106 المحتضنة مع الخلايا).
- يمكن إضافة رصيد إذابة الفيروسية مباشرة إلى وسائل الإعلام hESC الطازجة.
- تحديث وسائل الإعلام 12 و 24 ساعة في وقت لاحق.
- بعد 48 ساعة ، ويمكن أن الكفاءة التي تنبيغ نوعيا المقررة باستخدام المجهر مضان. بعد ذلك ، يمكن استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل الخلايا المصابة.
- hESCs زراعة ومقدمة لتصوير مجموعة المتابعة
- ثقافة إيجابية luciferase hESCs الخاص في التغذية الخالية من الشروط. نحن نتبع عادة بروتوكول معهد ويسيل القياسية واستخدام لوحات مغلفة جيدا 6 عامل النمو في خفض Matrigel ، وذلك باستخدام وسائل الإعلام إما مشروطة أو تجارية ، التغذية الخالية من وسائل الإعلام.
- للكشف عن خلايا luciferase إيجابية ، وسوف تحتاج إلى أن يكون التحقيق الصحفي D - luciferin أعدت مسبقا. للقيام بذلك luciferin قسامة ، في التحضيرات 1-1،5 مل بتركيز نهائي من 45 ملغ / مل. إبقاء aliquots في -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال ، وتجنب التعرض للضوء عن طريق تغطية مع منشفة ورقية في حالة عدم التخزين.
- من أجل رؤية الخلايا luciferase إيجابية ، ونحن نستخدم IVIS 50 و 200 IVIS أنظمة التصوير (Xenogen كوربوريشن ، ألاميدا ، كاليفورنيا). هذا النظام الأخير يتضمن جهاز متكامل وغرفة isoflourane التعريفي للتخدير مؤقت من الحيوانات الصغيرة.
- في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي المختبر hESCs
- عن المختبر في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي ، فمن المهم للحفاظ على ظروف معقمة. لذا ، ينبغي أن يكون نظام التصوير العقيمة ، ويفضل في خلية غرفة الثقافة.
- قبل التصوير ، وإزالة الخلايا وسائل الإعلام إضافة PBS ما يكفي لتغطية الخلايا. على سبيل المثال ، إضافة إلى برنامج تلفزيوني 1mL كل بئر من لوحة تحتوي على 6 - جيدا الثقافات hESC الخاص.
- نسبة إلى مد Luciferin PBS ينبغي 1:100 ، إضافة حتى 10 ميكرولتر من إذابة D - Luciferin إلى كل بئر من لوحة 6 - جيدا.
- الانتظار دقيقة واحدة ، ثم تأخذ صورة باستخدام وقت التعرض 1 ثانية. إذا إشارة ضعيفة ، وزيادة التعرض الفاصل وحاول مرة أخرى.
- إشارة bioluminescent يعكس عدد الخلايا ، لذلك لا يمكن أن يؤديها المقايسات الكميات التي ترتبط مع إشارة أرقام مختلفة من الخلايا.
- إعداد الماوس والخلايا في الجسم الحي عن طريق الحقن والتصوير
- مراسل الجين التصوير يوفر طريقة الإنتاجية العالية ، وغير مكلفة وحساسة للخلايا تتبع بعد زرع خلال الأيام والأسابيع وحتى أشهر. هذا مهم خصوصا زرع الخلايا الجذعية في كثير من الأحيان شكل teratomas ، مرفوضة من قبل النظام المناعي للمضيف ، أو ببساطة الموت.
- أبسط طريقة لتشكيل مسخي التصوير في الجسم الحي هي حقن hESCs التي تعبر عن هذا الجين يراعة مراسل luciferase في ظهور الفئران SCID والحصول على صور bioluminescent مع نظام IVIS.
- عندما كنت على استعداد لزرع الخلايا ، أو استخدام dispase كولاجيناز لتخفيف الخلايا ، ويغسل عدة مرات ، وتعليق عليها في خليط 1:1 من عامل النمو المنخفض وmatrigel DMEM. نحن عادة مزيج أولا الخلايا مع DMEM المبردة ثم إضافة في matrigel. لكل موقع الحقن تحت الجلد ، ونحن حقن خلايا معلقة في 200000 وحدة المجاهدين 5-10 من خليط matrigel / DMEM. ويمكن تعديل عدد الخلايا اعتمادا على التطبيق الخاص بك. تذكر أن تبقي كل شيء على الجليد قبل الحقن.
- مرة واحدة الخلايا جاهزة ، تخدير الماوس عن طريق وضعه في خانة التحريض مع تدفق isoflurane قيد التشغيل. بعد 1-5 دقائق ، والفأر هو نائم ويمكن وضعها على طاولة العمليات مع isoflurane المستمر.
- لأن الفراء الطبيعي والتلقائي تتفلور قد تحجب صورة bioluminescent ، سوف نحتاج لإزالة الشعر من الجانب الخلفي من الماوس. أسهل طريقة للقيام بذلك هو لاستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، ولكن يمكنك أيضا استخدام الشعر ازالة المواد الهلامية. محو مع الكحول لتعقيمالجلد بعد
- المقبل ، ووضع نظام التعليق الخاص خلية في المحاقن. إبر عيار 23-27 عمل أفضل لأنها لا تسد حتى مع الخلايا. إذا كانت إبرة كبيرة جدا (<23 مقياس) قد المسالك إبرة ترك حفرة واسعة من خلال الخلايا التي يمكن أن تسرب العودة.
- حقن الخلايا تحت الجلد في الظهر الفأر. لأن الجلد هو فضفاض جدا ، واستخدام الإبهام والسبابة لقرصة وتمتد المنطقة التي تريد لحقن. حقن تحت الجلد مباشرة ، مع الحرص على عدم ثقب عميق جدا. أيضا ، في محاولة للحفاظ على إبرة من الانزلاق للخروج من موقع الحقن ، بينما تضغط على المكبس : هذا سيمنع خلق ثقب في الجلد من خلالها الخلايا يمكن أن تسرب إذا حاولت حقن مرة أخرى.
- بعد أن يتم حقن هذه الخلايا ، والانتظار بضع ساعات للسماح للماوس ليستيقظ وتشغيل قبل إعادة حول التخدير لتصوير تلألؤ بيولوجي. بذلك يتجنب سمية isoflurane.
- في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي المجراة من الخلايا التي تم زرعها
- كله لتصوير الحيوان تلألؤ بيولوجي ، ونحن نفعل حقن داخل الصفاق مد luciferin في 375 وزن الجسم ملغم / كغم. وزن الحيوان لحساب الجرعات قبل الحقن.
- حقن D - luciferin في الصفاق ، قبالة خط الوسط. كن حذرا حتى لا تذهب عميقا جدا أو أنك يمكن أن تلحق الضرر الأعضاء الداخلية. إذا كان الماوس يبدأ يستيقظ ، وضعه مرة أخرى في مربع خروج المغلوب والانتظار لمدة دقيقة أو اثنتين. بالنسبة للفئران ، وتلألؤ بيولوجي أقصى يحدث عادة 15-40 دقيقة بعد الحقن.
- تذكر أن تضع ورقة سوداء في ماتي مربع التصوير للمساعدة في امتصاص أي ضوء لا ينبعث من hESCs. مكان الماوس (حتى المؤخر) في غرفة التصوير مع isoflurane ، على رأس ورقة سوداء. يبدأ وقت تعرض 10 ثانية. إذا المشبعة إشارة ، حاول تقليل مدة التعرض ، وإذا كان ضعيفا جدا ، وزيادة التعرض.
- مرة واحدة وقد تم تحسين زمن التعرض للإشارة الفأرة ، تبدأ التقاط الصور في كل دقيقة حتى تصل إلى إشارة الأقصى. من الأفضل القيام بذلك عن طريق استخدام برامج التصوير لتحديد "المناطق ذات الاهتمام (ROI)" التي تغطي مواقع الحقنة. من خلال رصد كثافة إشارة في كل ROI يمكنك بسهولة تحديد عندما تكون إشارة يبدأ في الانخفاض ، مشيرا إلى أنه تم التوصل إلى قوة إشارة الأقصى. وينبغي أن تستخدم إشارة الحد الأقصى من البيانات النهائية.
- عندما كنت راضيا الصور وإزالة الماوس من isoflurane وتسمح له أن يستيقظ في قفصه. عادة ، يجب أن يستيقظ الفأر في غضون 15 دقيقة.
- ويمكن تكرار الجين تلألؤ بيولوجي التصوير الصحفي اليومية والأسبوعية والشهرية لطالما hESCs البقاء في الحيوان. وإشارة من مسخي النامية تزيد أضعافا مضاعفة مع مرور الوقت ، وعادة بناء على أمر من أسابيع ، كما hESCs تبدأ في الانتشار.
- بعد الحصول على الوقت المطلوب طبعا من الصور تلألؤ بيولوجي ، قد تكون التضحية الحيوانية وقطاعات الأنسجة المستخدمة في علم الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالمقارنة مع وسائل أخرى مثل PET والتصوير بالرنين المغناطيسي ، وتلألؤ بيولوجي القرار المكاني المحدود وخفض اختراق الأنسجة نتيجة لضعف الطاقة نسبيا من الفوتونات (2-3 فولت) لهذه الأسباب أنها حتى الآن لم يتم تطبيق في الحيوانات الكبيرة. ومع ذلك ، تلألؤ بيولوجي لديها ميزة كونها منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية ، وغير الغازية ، مما يجعل من المرغوب فيه جدا عن الخلايا الجذعية في الجسم الحي في تتبع الحيوانات الصغيرة. ويمكن استخدام الجينات المراسل غير تلألؤ بيولوجي مثل يبني PET ومضان بالتزامن مع luciferase لخلق انصهار مراسل الجينات التي تتألف من مختلف المجالات التي تحتوي على جينات مراسل الفردية. على سبيل المثال ، مجموعتنا يستخدم الانصهار تتضمن بناء fluc ، موحودي بروتين فلوري الأحمر (mrfp) ، وفيروس الهربس البسيط اقتطاع ثيميدين كيناز (TTK ، وهو الجين مراسل PET) لتتبع طريقة متعددة من الخلايا الجذعية في سلوك الحيوانات الصغيرة. مع مرور الوقت ، قد الجينات مراسل ستابلي متكاملة تخضع لإسكات الجينات الصبغية من الأجهزة المحلية. يرتبط ارتباطا وثيقا الحساسية المورثة مراسل لإسكات الجينات لاختيار القيادة المروج تعبيرها. على سبيل المثال ، أسكت المروج المضخم للخلايا (pCMV) في hESCs. وكان مختبر نجاحنا جيدة مع المروج اليوبيكويتين - C الإنسان (العانة) إلى محرك تعبير عن الانصهار مزدوجة في بناء العديد من خطوط الخلايا hESC ، ولقد لاحظت فقدان الحد الأدنى من إشارة مرور الوقت.
في الختام ، وقبل hESC المستمدة من تجديد الخلايا تصبح ذات الصلة سريريا ، لا بد من التغلب على عقبات عدة البيولوجية الأساسية -- وهما أو موت الخلية المبرمج بعد زرع الخلايا المتمايزة ، وتشكيل خلايا غير متمايزة من مسخي ، والرفض المناعي عن طريق الكائن المضيف. هذه وغيرها من التحديات التي تسلط الضوء على الحاجة لengraftment hESC التتبع ، والبقاء والانتشار داخل الكائن المتلقي. وقد مكن تطوير تقنيات التصوير الجزيئي مثل يراعة مراسل الجين luciferase وكاميرات فائقة الحساسية CCD غير الغازية ، وتقييم المتكررة من موقع الخلية ، والهجرة ، والانتشار ، والتمايز في الجسم الحي. ومثل هذه التقنيات تساعد الترجمة دفع البيولوجيا hESC من المعمل نحو التطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بفضل تيم دويل ، دكتوراه ، ومركز ستانفورد للتصوير في الجسم الحي للحصول على المساعدة مع التصوير تلألؤ بيولوجي. أيضا بفضل هوانغ نغان ، دكتوراه لتقاسم تقنية الخلايا الجذعية لها على المشاركة في الحقن بمحلول المصفوفة. أخيرا ، بفضل ستيف فيلت ، دكتوراه للحصول على مساعدة رعاية الحيوانات البيطرية.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
