Summary
Avec l'intérêt croissant pour les thérapies de cellules souches, des techniques d'imagerie moléculaire sont idéales pour le comportement des cellules souches de surveillance après la transplantation. Gènes rapporteurs luciférase ont permis non invasive, l'évaluation répétitive de la survie cellulaire, l'emplacement et la prolifération in vivo. Cette vidéo vous montrera comment suivre la prolifération des CSEh dans une souris vivante.
Abstract
La découverte de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) a considérablement augmenté les outils disponibles pour les scientifiques médicaux s'intéressent à la médecine régénérative. Cependant, l'injection directe de CSEh, et les cellules différenciées de CSEh, dans les organismes vivants n'a jusqu'ici été entravée par la mort cellulaire importante, la formation de tératome, et le rejet immunitaire de l'hôte. Comprendre le comportement en CSEh in vivo après transplantation nécessite des techniques d'imagerie pour suivre longitudinalement la localisation de CSEh, la prolifération et la viabilité. L'imagerie moléculaire a donné enquêteurs un moyen à haut débit, peu coûteux et sensibles pour le suivi de la prolifération cellulaire in vivo sur plusieurs jours, semaines, voire des mois. Ce progrès a considérablement augmenté la compréhension de la cinétique spatio-temporelle de la greffe de CSEh, la prolifération et tératome-formation chez des sujets vivants.
Une avancée majeure dans l'imagerie moléculaire a été l'extension de la non-invasive des dosages gène rapporteur de la biologie moléculaire et cellulaire dans les plates-formes d'imagerie in vivo la multi-modalité. Ces gènes rapporteurs, sous contrôle de promoteurs d'ingénierie et exhausteurs qui tirent parti de la machinerie transcriptionnelle de la cellule hôte s, sont introduits dans les cellules en utilisant une variété de méthodes vectorielles et non vectorielles. Une fois dans la cellule, les gènes rapporteurs peuvent être transcrits soit de manière constitutive, ou seulement sous certaines conditions biologiques ou cellulaire, en fonction du type de promoteur utilisé. La transcription et la traduction des gènes rapporteurs dans les protéines bioactives est ensuite détecté grâce sensibles, l'instrumentation non invasive (par exemple, caméras CCD) à l'aide de signaux générant des sondes telles que D-luciférine.
Afin d'éviter le besoin de lumière excitatrice pour suivre in vivo les cellules souches est aussi nécessaire pour l'imagerie de fluorescence, bioluminescence systèmes d'imagerie du gène rapporteur exigent seulement une sonde exogène administrée pour induire une émission de lumière. Luciférase de luciole, dérivé de la pyralis firefly Photin, code pour une enzyme qui catalyse D-luciférine le métabolite actif optiquement, oxyluciférine. Activité optique peut alors être contrôlé avec une caméra CCD externes. Stablement transduites cellules qui transportent le journaliste de construire au sein de leur ADN chromosomique va passer le journaliste construction d'ADN à des cellules filles, permettant un suivi longitudinal de la survie et la prolifération des CSEh in vivo. Par ailleurs, parce que l'expression du produit du gène rapporteur est requis pour la génération du signal, seule solution viable cellules mère et fille, va créer le signal de bioluminescence; cellules apoptotiques ou morts ne sera pas.
Dans cette vidéo, les matériaux spécifiques et les méthodes nécessaires pour la prolifération des cellules souches de suivi et de formation de tératome avec l'imagerie par bioluminescence seront décrites.
Protocol
- Construction du gène de fusion Reporter double
- Afin d'effectuer l'imagerie par bioluminescence de cellules souches embryonnaires humaines, vous devez d'abord obtenir des cellules expriment de façon stable un gène rapporteur luciférase tels que la luciférase de luciole piloté par un promoteur constitutif, comme l'ubiquitine ou EF1a.
- L'objectif de ce protocole est sur les applications du gène rapporteur, alors procédures détaillées ne sont pas fournies ici. Cependant, la stratégie générale de notre laboratoire est d'utiliser un vecteur double fusion qui contient de construire la luciférase de luciole (fluctuations) et amélioré la protéine fluorescente verte (EGFP) séparés par une entretoise au sein pCDNA 3.1 +.
- En bref, notre gène double fusion était initialement situé en aval du promoteur de cytomégalovirus dans pcDNA 3.1 (+), de sorte que le fragment de 3,3 kpb a été excisé par digestion Ndel et Notl et à bout émoussé ligaturé dans le site de clonage multiple d'une auto-inactivation (NAS ) vecteur lentiviral, sous contrôle d'un promoteur de l'ubiquitine.
- Transduction lentiviraux
- CSEh peuvent être transduites 3-5 jours après le passage à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 (titre viral d'environ 107 106 cellules incubées avec).
- Le stock dégelé virale peut être ajouté directement aux médias CSEh frais.
- Actualiser les médias 12 et 24 heures plus tard.
- Après 48 h, l'efficacité de transduction peut par une évaluation qualitative en utilisant la microscopie à fluorescence. Par la suite, FACS peut être utilisé pour isoler les cellules infectées.
- CSEh Culture et Introduction à l'imagerie Set-up
- Culture de votre luciférase CSEh positifs dans le chargeur sans conditions. Nous généralement suivre le protocole standard WiCell et l'utilisation des plaques 6 puits recouvert de facteur de croissance réduite de Matrigel, en utilisant soit des milieux conditionnés ou commerciales, chargeur-média libre.
- Pour détecter les cellules luciférase positif, vous aurez besoin d'avoir la sonde journaliste de D-luciférine déjà préparé. Pour ce faire partie aliquote luciférine, en 1 à 1,5 ml des préparations à une concentration finale de 45 mg / mL. Gardez les aliquotes à -20 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé et éviter l'exposition à la lumière en couvrant avec un papier absorbant quand il n'est pas dans le stockage.
- Afin de visualiser les cellules luciférase positif, nous utilisons IVIS 50 et 200 systèmes d'imagerie IVIS (Xenogen Corporation, Alameda, Californie). Ce dernier système comprend un appareil intégré et de la chambre d'induction isoflourane pour l'anesthésie temporaire de petits animaux.
- Dans l'imagerie par bioluminescence in vitro des CSEh
- Pour l'imagerie par bioluminescence in vitro, il est important de maintenir des conditions stériles. Par conséquent, le système d'imagerie doivent être stériles, de préférence dans une salle de culture cellulaire.
- Avant d'imagerie, retirez le support de cellule et d'ajouter juste assez pour couvrir PBS les cellules. Par exemple, ajouter 1 ml de PBS dans chaque puits d'une plaque de 6 puits contenant vos cultures de CSEh.
- Le rapport de la D-luciférine à PBS doit être 1:100, donc ajouter 10 ul de décongelés D-luciférine dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
- Attendez une minute, puis prendre une image en utilisant un temps d'exposition de 1 seconde. Si le signal est faible, augmentez l'intervalle d'exposition et essayez à nouveau.
- Le signal bioluminescent reflète le nombre de cellules, donc des tests de quantification peut être effectuée en corrélation du signal avec le nombre de cellules différentes.
- Préparation de la souris et les cellules d'injection pour l'imagerie in vivo
- Gène rapporteur imagerie fournit une méthode à haut débit, peu coûteuses et sensibles pour les cellules de suivi après la transplantation au fil des jours, des semaines, voire des mois. Ceci est particulièrement important car les cellules souches greffées forment fréquemment tératomes, sont rejetés par le système immunitaire de l'hôte, ou tout simplement mourir.
- La méthode la plus simple pour la formation de tératome imagerie in vivo consiste à injecter de CSEh qui expriment le gène rapporteur luciférase firefly dans le dos des souris SCID et d'acquérir des images de bioluminescence avec le système IVIS.
- Lorsque vous êtes prêt à transplanter des cellules, l'utilisation ou la collagénase dispase à desserrer les cellules, se laver plusieurs fois, et les suspendre dans un mélange 1:1 de facteur de croissance réduit Matrigel et DMEM. Généralement nous avons d'abord mélanger les cellules avec du DMEM et refroidi, puis ajouter dans le Matrigel. Pour chaque site d'injection sous-cutanée, nous injectons 200 000 cellules en suspension dans un volume de 50 à 100 ul du mélange matrigel / DMEM. Le nombre de cellules peut être ajustée en fonction de votre application. N'oubliez pas de garder tout sur la glace avant l'injection.
- Une fois que les cellules sont prêtes, anesthésier la souris en la plaçant dans la boîte à induction à débit isoflurane allumé. Après 1-5 minutes, la souris est endormi et peut être placé sur la table d'opération avec l'isoflurane continu.
- Parce que la fourrure naturelle d'auto-fluorescence et peuvent obscurcir l'image bioluminescents, nous aurons besoin pour enlever les poils de la face arrière de la souris. La meilleure façon de faire est d'utiliser un rasoir électrique, mais vous pouvez également utiliser des gels d'épilation. Essuyez-les avec l'alcool pour stériliserla peau après
- Ensuite, dessinez votre suspension cellulaire dans une seringue. 23 à 27 aiguilles de calibre meilleur travail puisqu'ils ne seront pas obstruer avec des cellules. Si l'aiguille est trop importante (<23 gauge) le tractus aiguille peut laisser un grand trou par lequel les cellules peuvent fuir arrière.
- Injecter des cellules sous la peau dans le dos de la souris. Parce que la peau est assez lâche, utiliser votre pouce et l'index pour pincer et étirer la zone que vous voulez injecter. Injectez sous la peau, en prenant soin de ne pas percer trop profondément. Aussi, essayez de garder l'aiguille de glisser hors du site d'injection tout en appuyant sur le piston: cela empêchera la création d'un trou dans la peau par lequel les cellules peuvent fuir si vous essayez d'injecter à nouveau.
- Après les cellules sont injectés, attendre quelques heures afin de permettre la souris pour se réveiller et courir avant de re-anesthésier d'imagerie par bioluminescence. Cela évite la toxicité isoflurane.
- Dans l'imagerie par bioluminescence in vivo des cellules transplantées
- Pour l'imagerie par bioluminescence des animaux entiers, nous ne l'injection intrapéritonéale de D-luciférine à 375 mg / kg. Peser les animaux de calculer la dose avant l'injection.
- Injecter le D-luciférine dans le péritoine, juste à côté de la ligne médiane. Soyez prudent de ne pas aller trop profondément ou vous pouvez endommager les organes internes. Si la souris commence à se réveiller, le replacer dans la boîte de KO et attendez une minute ou deux. Pour les souris, la bioluminescence maximale survient généralement 15-40 minutes après l'injection.
- N'oubliez pas de placer papier mat noir dans la boîte d'imagerie pour aider à absorber toute la lumière n'est pas émise par les CSEh. Placez la souris (jusqu'à arrière) dans la chambre de l'imagerie avec l'isoflurane, sur le dessus du papier noir. Commencez avec un temps d'exposition de 10 secondes. Si le signal est saturé, essayez de diminuer le temps d'exposition; si elle est trop faible, augmenter l'exposition.
- Une fois le temps d'exposition du signal a été optimisé pour votre souris, commencez à prendre des images à chaque minute jusqu'à ce que le signal atteigne un maximum. Le mieux est fait en utilisant le logiciel d'imagerie pour sélectionner "des régions d'intérêt (ROI)" qui couvrent vos sites d'injection. En surveillant l'intensité du signal à chaque ROI, vous pouvez facilement déterminer si le signal commence à diminuer, ce qui indique que l'intensité du signal maximal a été atteint. Le signal maximal devrait être utilisé comme vos données finales.
- Lorsque vous êtes satisfait de vos images, enlever la souris de l'isoflurane et de lui permettre de se réveiller dans sa cage. Habituellement, la souris doit se réveiller dans les 15 minutes.
- L'imagerie par bioluminescence gène rapporteur peut être répété quotidiennement, hebdomadaire et mensuelle pour aussi longtemps que les CSEh survivre dans l'animal. Signal provenant d'un tératome en développement augmentera de façon exponentielle au fil du temps, typiquement de l'ordre de quelques semaines, comme le CSEh commencent à proliférer.
- Après le cours du temps désiré d'images de bioluminescence est acquise, l'animal peut être sacrifié et des coupes de tissus utilisés pour l'histologie.
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Discussion
Comparé à d'autres modalités telles que la TEP et l'IRM, la bioluminescence a limité la résolution spatiale et la pénétration tissulaire réduite en raison de l'énergie relativement faible de photons émis (2-3 eV); pour ces raisons, il n'a jusqu'ici pas été applicables dans les grands animaux. Toutefois, la bioluminescence a l'avantage d'être à faible coût et à haut débit, et non invasive, ce qui rend hautement souhaitable pour les cellules souches in vivo de suivi dans les petits animaux. Gènes rapporteurs non-bioluminescence tels que les constructions en PET et de fluorescence peut être utilisée en conjonction avec la luciférase pour créer un gène rapporteur de fusion qui est composé de différents domaines contenant les gènes rapporteurs individuels. Par exemple, notre groupe utilise une construction de fusion contenant fluctuations, monomérique protéine fluorescente rouge (RDRF), et le virus Herpes simplex thymidine kinase tronquée (TTK, un gène rapporteur PET) pour la multi-modalité de suivi du comportement des cellules souches chez les petits animaux. Au fil du temps, des gènes rapporteurs intégré de manière stable peuvent être soumis à inactivation des gènes par la machinerie endogènes chromosomiques. La susceptibilité d'un gène rapporteur de silençage génique est étroitement liée au choix du promoteur de conduite de son expression. Par exemple, le promoteur du cytomégalovirus (pCMV) est rapidement réduit au silence dans les CSEh. Notre laboratoire a eu un bon succès avec les humains ubiquitine-C promoteur (pubis) pour conduire l'expression d'une double fusion construire dans plusieurs lignées cellulaires CSEh, et ont observé une perte de signal minimale au cours du temps.
En conclusion, avant de CSEh dérivées régénération cellulaire devient cliniquement pertinente, plusieurs obstacles biologiques fondamentaux doivent être surmontés - la mort cellulaire ou apoptose savoir après une transplantation de cellules différenciées, la formation de tératome à partir des cellules indifférenciées, et le rejet immunitaire par l'organisme hôte. Ces défis et d'autres soulignent la nécessité d'greffe CSEh suivi, la survie et la prolifération au sein de l'organisme receveur. Le développement des techniques d'imagerie moléculaire tels que le gène rapporteur luciférase Firefly et ultra-sensibles caméras CCD a permis non invasive, l'évaluation répétitive de la localisation cellulaire, la migration, la prolifération et la différenciation in vivo. Les technologies telles que celles-ci aideront la traduction pousser de la biologie de CSEh à partir du laboratoire vers les applications cliniques.
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Acknowledgments
Merci à Tim Doyle, PhD, et le Centre Stanford pour l'imagerie in vivo pour l'aide à l'imagerie par bioluminescence. Merci aussi à Ngan Huang, PhD pour le partage de sa technique sur les cellules souches co-injection avec une solution de la matrice. Enfin, grâce à Steve Felt, Ph.D. pour l'aide aux soins des animaux à usage vétérinaire.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
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