Summary
幹細胞治療への関心の高まりとともに、分子イメージング技術は、移植後の幹細胞の挙動のモニタリングに最適です。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、細胞の生存、場所、およびin vivoでの増殖の非侵襲的、反復的な評価を可能にした。このビデオでは、生きたマウスでのヒトES細胞の増殖を追跡する方法を説明します。
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）の発見は劇的に再生医療に興味のある医学者が利用できるツールが増えています。しかし、生体に、ヒトES細胞から分化したヒトES細胞、および細胞の直接注入は、これまで顕著な細胞死、奇形腫形成、および宿主の免疫拒絶反応によって妨げられている。移植後のin vivoでヒトES細胞の行動に理解することは新たなイメージング技術は、長手方向にhESCのローカライズ、増殖、および生存率を監視する必要があります。分子イメージングは、調査官の数日、数週間、さらには数ヶ月にわたってin vivoでの細胞増殖に追跡するための、ハイスループットで安価、かつ高感度な手段を与えている。この進歩は著しくhESCの生着、増殖、そして生きている被験者におけるテラトーマ形成の時空間動態の理解を増加している。
分子イメージングにおける大きな進歩は、生体内でのマルチモダリティ画像処理プラットフォームへの分子細胞生物学から非侵襲的なレポーター遺伝子アッセイの拡張となっています。これらのレポーター遺伝子は、宿主細胞の転写機構を利用する人工プロモーターとエンハンサーの制御下、ベクトルおよび非ベクトルの様々な方法を用いて細胞に導入されています。一度セルに、レポーター遺伝子が使用されるプロモーターの種類に応じて、特定の生物学的または細胞の条件の下で恒常的にまたはいずれか一方のみ転写することができます。生理活性タンパク質へのレポーター遺伝子の転写と翻訳は、その後、D -ルシフェリンのような信号を発生するプローブを使用して機密情報、非侵襲的計測機器（例えば、CCDカメラ）で検出される。
蛍光イメージングのために必要とされるin vivoで幹細胞を追跡するために、興奮性、光の必要性を避けるために、生物発光レポーター遺伝子イメージングシステムは、発光を誘導するだけ外因的に投与プローブが必要です。ホタルPhotinusスピラリスから派生したホタルルシフェラーゼは、光学活性代謝物、オキシルシフェリンにD -ルシフェリンを触媒する酵素をコードしている。光学活性を、外部のCCDカメラで監視することができます。安定してレポーターを運ぶ細胞はその染色体DNA内に構築形質レポーターがin vivoでのヒトES細胞の生存や増殖の長手方向の監視を可能にする、娘細胞にDNAを構築渡します。レポーター遺伝子産物の発現は、信号の生成に必要となるためさらに、唯一の現実的親と娘細胞は、生物発光のシグナルを作成します。アポトーシスまたは死細胞はしません。
このビデオでは、生物発光イメージングによる追跡幹細胞の増殖と奇形腫形成に必要な特定の材料および方法について説明する。
Protocol
- ダブル融合レポーター遺伝子の構築
- ヒト胚性幹細胞の生物発光イメージングを行うためには、まず安定的にそのようなユビキチンまたはEF1aのような構成的プロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼなどのルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞を取得する必要があります。
- このプロトコルの焦点は、レポーター遺伝子のアプリケーション上にある、詳細な手順はここで提供されていないので。しかし、私たちの研究室の一般的な戦略は、pCDNA 3.1内スペーサー+で区切られたホタルルシフェラーゼ（変動を確認）と強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を含むベクターを構築ダブルフュージョンを使用することです。
- 簡単に言えば、私たちの二重融合遺伝子は、もともとpCDNA 3.1のサイトメガロウイルスプロモーター（+）の下流に位置していたので、3.3 kbpの断片を自己不活性化（SINのマルチクローニングサイトにライゲーションをNdeIおよびNotIで消化し、平滑末端を用いて切り出し、ユビキチンプロモーターの制御下にある）レンチウイルスベクター、。
- レンチウイルス形質導入
- ヒトES細胞は、10の感染多重度（MOI）（106細胞とインキュベートした約107個のウイルス力価）で継代した後3-5日を形質導入することができます。
- 融解ウイルスストックは、新鮮なhESCのメディアに直接追加することができます。
- 媒体12および24時間後をリフレッシュします。
- 48時間後、形質導入効率はによって定性的に蛍光顕微鏡を用いて評価することができます。その後、FACSは、感染細胞を単離するために使用することができます。
- 培養ヒトESおよびセットアップイメージング入門
- の文化あなたのルシフェラーゼ正ヒトES細胞をフィーダーフリーの条件。我々は通常、標準WiCellのプロトコルに従い、馴化培地または商用のいずれかを使用してマトリゲル削減成長因子でコーティングした6ウェルプレート、、フィーダーフリーメディアを使用してください。
- ルシフェラーゼ陽性細胞を検出するには、レポータープローブD -ルシフェリンがすでに準備されている必要があります。 45 mg / mLの最終濃度が1から1.5 mLの調製物中の上澄みルシフェリン、これを行うには。時ではないストレージにペーパータオルで覆うことにより、光への曝露を使用して回避しないで時-20℃で分注してください。
- ルシフェラーゼ陽性細胞を可視化するために、我々は、IVIS 50、IVIS 200イメージングシステムを（Xenogen社、アラメダ、カリフォルニア州）を使用します。この後者のシステムでは、小動物の一時的な麻酔のための統合isoflourane装置と誘導室が含まれています。
- ヒトES細胞のin vitroでの生物発光イメージングに
- in vitroでの生物発光イメージングのためには、無菌状態を維持することが重要です。したがって、イメージングシステムは、好ましくは細胞培養室で、無菌でなければなりません。
- イメージングの前に、細胞培地を除去し、細胞をカバーするだけの十分なPBSを加える。たとえば、hESCの文化を含む6ウェルプレートの各ウェルに1mLのPBSを加える。
- PBSにD -ルシフェリンの比率は、6ウェルプレートの各ウェルに解凍したD -ルシフェリンの10μLを加えるので、1:100である必要があります。
- 1分間待機し、その後1秒の露光時間を使用してイメージを取る。信号が弱い場合は、露出の間隔を長くして再試行してください。
- 生物発光シグナルは、細胞数を反映し、定量アッセイが異なる細胞数で信号を相互に関連付けることが実行できるように。
- in vivoイメージングのためのマウスと注入細胞の調製
- レポーター遺伝子イメージングは日、週、そしてさらに数ヶ月にわたって移植後の細胞を追跡するため、ハイスループット、安価で感度の高い方法を提供する。移植された幹細胞は、頻繁に、奇形腫を形成する宿主の免疫システムによって拒絶されている、または単に死ぬので、これは特に重要です。
- in vivoでのイメージング奇形腫形成のための最も簡単な方法は、SCIDマウスの背部にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現し、IVISシステムで生物発光画像を取得するヒトES細胞を注入することです。
- あなたが細胞を移植する準備ができたら、、細胞を緩めて数回洗浄し、そしてDMEM -マトリゲルを削減成長因子の1:1混合物でそれらを中断するディスパーゼまたはコラゲナーゼを使用してください。一般的に我々は最初のチルドDMEMで細胞を混合し、マトリゲルに追加してください。それぞれの皮下注射部位では、マトリゲル/ DMEM混合物の50〜100μLの容積に懸濁した20万セルを注入する。細胞数は、アプリケーションに応じて調整することができます。注射前に氷の上のすべてを維持してください。
- 細胞が準備ができたら、オンにイソフルランフローとインダクションボックスに置くことによって、マウスを麻酔。 1〜5分後、マウスが眠っていると、連続イソフルランと手術台上に配置することができます。
- 毛皮自然に自動蛍光を発するとは、生物発光画像を覆い隠す可能性があるため、我々は、マウスの裏面から毛を削除する必要があります。これを行う最も簡単な方法は、電気シェーバーを使用することですが、あなたも脱毛のゲルを使用することができます。滅菌にアルコールで拭いてくださいその後皮膚
- 次に、注射器で細胞懸濁液を描く。彼らは細胞を詰まらせることはありませんので、23から27ゲージの針が最適です。針は、（<23ゲージ）が大きすぎる場合、針管は、細胞が戻って漏れるできるような大きな穴が残る場合があります。
- マウスの背中に皮膚の下に細胞を注入する。肌がかなり緩んでいるので、挟まないように親指と人差し指を使用し、注入する領域を差し伸べる。あまりにも深く穿刺するように注意していないながら、皮膚のすぐ下に注入する。また、プランジャーを押しながら注射部位から滑り落ちるから針を維持しようとする：これは再び挿入しようとすると、細胞がリークすることができますを介して皮膚に穴を作成できなくなります。
- 細胞が注入された後、マウスが目を覚ますと生物発光イメージングのために再麻酔の前に周りの実行を許可するように数時間を待つ。そうすることで、イソフルラン毒性を回避することができます。
- 移植細胞のin vivo生物発光イメージングに
- 全体の動物の生物発光イメージングのために、我々は、375 mg / kg体重でのD -ルシフェリンを腹腔内注射を行います。注射前に投与量を計算するために動物を量る。
- ちょうど正中線から、腹膜にD -ルシフェリンを注入する。あまり深く行かないしたり、内臓に損傷を与えることができるように注意してください。マウスが目を覚ますに始まる場合は、ノックアウトのボックスに戻ってそれを配置し、1〜2分待つ。マウスの場合、最大の生物発光は、通常、注射後15〜40分を発生します。
- ヒトES細胞から放出されるではない任意の光を吸収するためのイメージングボックスにマット黒い紙を置くことを忘れないでください。黒い紙の上に、イソフルランの撮像室内でマウス（裏面を上にして）置きます。 10秒の露光時間で始まります。信号が飽和している場合、露光時間を減らしてみてください。弱すぎる場合、露出を増加させる。
- 信号の露光時間が、あなたのマウスに最適化されると、信号が最大値に達するまで、毎分の画像を撮影開始。これは最適な注射部位をカバーする"関心領域（ROI）"を選択するイメージングソフトウェアを使用して行われます。各ROIでの信号強度を監視することにより、簡単に最大の信号強度に達したことを示す、信号が低下し始める時に決定することができます。最大信号は、最終的なデータとして使用する必要があります。
- あなたがあなたのイメージに問題がなければ、イソフルランからマウスを削除し、そのケージに目を覚ますことができます。通常、マウスは15分以内に目覚めるはず。
- ヒトES細胞は動物の中で生き残るように生物発光レポーター遺伝子イメージングは、長い間、毎日、毎週、毎月繰り返すことができます。ヒトES細胞が増殖し始めると、発展途上奇形腫からの信号は、通常、数週間のために、時間の経過とともに指数関数的に増加します。
- 生物発光画像の所望の時間経過を取得した後、動物を屠殺し、組織切片は、組織学のために使用することができます。
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Discussion
PETやMRIなどの他のモダリティに比べて、生物発光は、限られた空間分解能と放出された光子の比較的弱いエネルギー（2-3 eV）のために少なく組織の浸透があり、これらの理由から、それはこれまで大規模な動物には適用されていない。しかし、生物発光は、小動物の追跡生体の幹細胞のためのそれは非常に望ましいこと、低コスト、高スループット、および非侵襲性という利点があります。 PETや蛍光構造などの非生物発光レポーター遺伝子は個々のレポーター遺伝子を含有する別のドメインで構成されている核融合のレポーター遺伝子を作成するためにルシフェラーゼと組み合わせて使用することができます。例えば、私たちのグループは、変動を確認、単量体の赤色蛍光タンパク質（MRFP）、および単純ヘルペスウイルスを含有する融合構築物を使用して小動物の幹細胞の挙動のマルチモダリティの追跡のためにチミジンキナーゼ（TTK、PETレポーター遺伝子を）切り捨てられます。時間が経つにつれて、安定的に統合されたレポーター遺伝子は、内因性染色体の機械による遺伝子サイレンシングの対象となる場合があります。遺伝子サイレンシングへのレポーター遺伝子の感受性は、密接にその発現を駆動するプロモーターの選択に関連している。例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（のpCMV）は迅速にヒトES細胞に沈黙される。私たちの研究室は、ダブルフュージョンの発現を駆動するためにヒトユビキチン- Cプロモーター（恥骨）との良好な成功を収めている複数のhESCの細胞株で構築し、時間をかけて最小限の信号損失を観察している。
、分化した細胞の移植後、すなわち細胞死やアポトーシスを未分化細胞からの奇形腫形成、および宿主生物による免疫拒絶反応 - ヒトES細胞由来の細胞の再生が臨床的に関連になる前に結論では、、いくつかの基本的な生物学的ハードルを克服しなければならない。これらおよび他の課題は、宿主内でヒトES細胞の生着、生存、および増殖を追跡するための必要性を強調。このようなホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子と超高感度CCDカメラなどの分子イメージング技術の開発は、セルの位置、移動、増殖、およびin vivoでの分化の非侵襲的、反復的な評価を可能にしました。このような技術が臨床応用に向けて研究室からのhESCの生物学の翻訳をプッシュするのに役立ちます。
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Acknowledgments
ティムドイル博士と生物発光イメージングの支援のためのin vivoイメージングのためのスタンフォードセンターに感謝します。また、マトリックス溶液と幹細胞の共同注射で彼女のテクニックを共有するためのパンガン黄、博士のおかげ。最後に、スティーブのおかげで、博士号を取得してフェルト獣医、動物のケアと支援のための。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
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