Summary
우리는 개발하는 동안 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인했습니다. 우리는 조혈 줄기 세포 (HSCs)이 생성되는 독특한 microenvironmental 틈새의 태반에서 확장 둘 발견했습니다. 여기, 우리는 마우스 태반에 HSCs의 격리 및 시각화에 필요한 실험 기법을 설명합니다.
Abstract
조혈 줄기 세포 (HSCs)는 자기 갱신과 개인의 일생 동안 혈액 lineages 모든 세포 유형을 생성하는 기능이 있습니다. 모든 HSCs는 수영장 크기가 셀프 갱신 세포 분열에 의해 유지되는 후, 배아 발달 동안 등장. 많은 해부 학적 사이트가 태아의 조혈 동안 참여로 HSC 발전의 과정을 규제 HSCs하고 중요한 발달 사건의 해부 출처를 확인하는 것은 복잡하고 있습니다. 최근, 우리는 HSCs가 (Gekas, 외 2005, 로즈, 외 2008) 생성과 독특한 microenvironmental 틈새에 확장하는 중요한 조혈 기관으로 태반을 확인. 따라서 태반들이 출현 및 초기 확장 중에 HSCs의 중요한 원천입니다.
이 문서에서는, 우리는 E10.5 각각 HSCs의 개시와 태반에서 HSC 수영장의 크기에 최대의 발달 단계에 해당 E12.5 태아, 태반에서 murine의 격리에 대한 해부 기술을 보여줍니다. 또한, 우리는 유동세포계측법 또는 기능 assays에 사용하기 위해 단일 세포 현탁액에 placental 조직의 효소 및 기계적 분리에 대한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 우리는 태반의 단일 세포에 대한 사용 중지 collagenase의 사용 HSCs의 충분한 수율을 제공 것으로 나타났습니다. 태반에서 HSC 수율에 영향을 미치는 중요한 요소는 사전에 기계적 분리의 정도, 그리고 효소 치료의 기간입니다.
우리는 또한 정확한 세포 틈새에 immunohistochemistry으로 HSCs을 개발의 시각화를위한 고정 냉동 placental 조직 섹션의 준비를 위해 프로토콜을 제공합니다. 조혈 특정 항원이 파라핀 임베디드 섹션의 준비 기간 동안 보존되지 않습니다, 우리는 정기적으로 placental HSCs과 progenitors을 번역을위한 고정 냉동 섹션을 사용합니다.
Protocol
1. 배아 제거 및 placental 해부
- 시작하려면, 배아 먼저 임신 댐에서 격리해야합니다.
- 동물이 승인 절차에 따라 euthanized 있습니다 - 우리 사건에서 우리는 마취 isoflurane의 치사량을 사용하는거야
- 첫째, 에탄올과 복부를 스프레이하고 가위로 작은 절개를합니다.
- 복부를 발견하고 복막을 열고 잘라 양손으로 피부를 떠날.
- 포셉로 자궁 뿔을 선택하고 각 말초 끝에 가위를 사용하여 수집합니다. PBS 얼음에 장소로 가득 배양 접시에있는 자궁 뿔를 놓습니다. 또한 태반을 분리하기 전에 PBS로 여러 번 씻어 기억 해요. 우리는 이제 태반을 분리하실 수 있습니다.
- 이 집게로 조심스럽게 배아 conceptuses를 둘러싼 자궁 내막 조직을 물러나고 시작합니다. 하나는 안 찔린 또는이 이후 절개 단계를 복잡하므로 별도의 배아에 구조적 피해를 입힐 신중해야합니다.
- 얼음 PBS와 함께 새로운 배양 접시에있는 고립된 conceptuses를 배치하고 모든 conceptuses이 endometrium에서 해방 때까지 계속합니다.
- 현미경 거리에 태반에서 decidua 껍질이 집게와 배치 PBS와 함께 새로운 배양 접시 하나 conceptus를 전송합니다. decidua 세포는 단일 세포 현탁액 및 유동세포계측법 방해하므로 가능한 decidua의 많은를 제거합니다. 부드러운 필링 지속적인 운동은 최상의 결과를 달성하는 것이 좋습니다.
- 두 기관 사이의 교차점에있는 태반에서 멀리 난황을 잘라 부드럽게 태반에서 떨어져 난황 및 vitelline 혈관을 가져옵니다. 관리는 특히 초기 태아와 태반의 chorionic 번호판을 방해하지 않도록해야합니다.
- 조심스럽게 한 쌍의 집게의 다른과 탯줄과 태반의 chorionic 접시를 들고, 멀리 태반에서 탯줄과 연결된 태아를 가져옵니다.
- 단일 세포 현탁액의 준비 기간 동안 clumping 휴대폰을 최소화하기 위해 태반의 가장자리에 여분의 거대 세포 조직을 제거합니다.
- PBS 5% FCS와 얼음 등 15 ML 팔콘 튜브로 적당한 용기에 태반을 수집합니다. 해부 모든 placentas에 대해이 작업을 수행합니다.
- 이 시점에서, 여러분은 이러한 체외 문화 또는 이식처럼 유동세포계측법, 기능 assays를위한 단일 세포 현탁액의 준비와 진행하거나 조직 고정 및 최종 immunohistochemistry에 대한 삽입 고정 냉동 블록 전체가 태반을 준비합니다.
2. 태반 조직의 단일 세포 현탁액의 준비
- 외과 분석을위한 태반에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 방법을 우리는 지금이 표시됩니다.
- 단세포 태반에서 서스펜션, 기계 및 효소 분해를 준비하는 것이 필요합니다. 먼저 10% FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션으로 PBS에 0.1 % Collagenase 솔루션을 준비합니다.
- 당신은 얼마나 많은에 따라 placentas에 collagenase 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 두 번 태반 볼륨 2 - 5ml 사이에 볼륨을 권장합니다.
- 기계식 바늘을 3 회를 통해 collagenase 솔루션과 태반을 passaging하여 조직을 방해하는 5 ML 주사기에 장착 16 G 바늘을 사용합니다. 18 G 바늘로 반복합니다.
- 45 분 동안 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 샘플을 놓으십시오.
- collagenase 20 G 바늘을 통해 통과 셀 솔루션, 그리고 37, 추가 45 분 동안 품어 ° C.에 45 분 부화 후
- 각각의 바늘로 22 - G 25 - G의 바늘을 통해 collagenase, 통로 세포 솔루션에서 1.5 시간 배양 후 총 3 회.
- 새로운 15 ML 팔콘 튜브에 연결된 50 μm의 필터를 통해 샘플을 필터, 4 PBS 5% FCS와 원심 분리기로 씻어 ° C를 5 분간 300 × G.
- 이 시점에서, 우리는 외과의 분석 또는 기능 assays에 적합한 단일 세포 현탁액 있습니다.
3. 냉동 섹션에 대한 조직의 고정
- 즉시 각 배아에서 태반을 분리 후, 그들은 차가운 1X PBS에 배치됩니다. 보통 96 - 웰 플레이트 젊은 placentas (E8.5 - 11.5)에 가장 잘 작동하지만, 오래된 placentas과 E12.5 세 이상은 24 잘 플레이트 더 편리합니다.
- 각각의 태반은 갓 해동 4% paraformaldahyde 또는 PFA 잘 채워진 새로 전송됩니다. E12.5 placentas 경우, 조직은 손으로 뉴 웰로 이동하지만, E10.5 위해서는 피펫과 함께 신중하게 PBS를 제거하고 PFA를 추가할 수 있습니다. 그것은 태반이 완전히 조직의 나이와 크기에 따라, 4 ° C에서 2~4시간 위해 잠겨 것이 중요합니다.
- 30 % 자당에 조직을 전송하거나, 조직은 매우 작고 연약 경우, PFA를 대기음 직접 자당을 추가합니다. 이 단계에서는 placentas는 솔루션에 떠있는 것입니다. 조직은 4 박하자 ° C.
- 30 % 자당의 야간 단계 후, 조직은 궁극적으로 적절한 cryopreservation 나타내는 우물의 바닥에 침몰한다. 자당 솔루션의 절반을 제거하고 OCT로 볼륨을 교체하고 ° C 1-2시간 4에서 다시 조직을 놓으십시오. 이것은 OCT 침투를 용이하게합니다.
- 그것이 임베디드 수있는 후 1 시간 100 % OCT 수있는 조직을 전송합니다.
4. 고정 조직을 포함
- 적절한 조직 식별 (쇼 예를 들어 곰팡이)와 레이블 플라스틱 금형.
- OCT 솔루션의 조직을 당겨 아래로 향하게 탯줄 사이드와 디스크 모양의 태반을 orienting 조심스럽게 깨끗한 면도날이되도록 압력을 방출하기 전에 앞뒤로 블레이드를 이동해야하는과 깔끔히하여 절반으로 태반을 잘라 심지어 컷. 태반은 나중에 placental HSCs을 시각화하는 가장 좋은 prientation을 달성하기 반으로 있습니다.
- 금형의 하단 표면에 접촉 컷 가장자리와 금형의 하단에 놓으 태반의 절반. 다른 반쪽에 대한 새로운 금형과 반복합니다. E10.5 placentas 들어, 두 반쪽은 동일한 기술을 사용하여 동일한 금형에 게재될 수 있습니다.
- 금형에 OCT를 따르고 때, 그것은 적절한 방향 placentas을 유지하기 어려울 수 있습니다. 포셉와 조직 절반을 누른 위치에 태반을 확보. 천천히 금형에 OCT 솔루션을 부어하고 거품을 생산하지 마십시오. E10.5 placentas 들어, 포셉 한 조직 절반을 보유하고 포셉의 외부에 대한 다른 조직 절반을 나머지. 천천히 같은 E12.5 placentas에 대한 설명 OCT 솔루션을 부어.
- 곰팡이가 OCT 가득되면, 신속하게 드라이 아이스로 금형을 배치, OCT는 조직을 냉동 흰 플래시를 설정합니다
- Drierite을 포함하는 작은 비닐 봉지에 곰팡이를 놓고 즉시 -80 ° C의 냉동고에 저장합니다.
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Discussion
이 프로토콜에서 설명하는 실험 절차는 placental 조직 및 조혈 줄기 및 전구 세포의 분리 및 시각화를위한 수 있습니다. 태아 발달에 걸쳐 태반 및 기타 태아 조혈 장기에 HSCs의 예상 세포 수율과 전화 번호에 대한 포괄적인 요약을 위해 우리는 Gekas, 외를 참조하십시오. 2005. 태반의 개발 HSCs 및 기타 조혈 세포의 지방화에 대한 우리 로즈, 외를 참조하십시오. 2008.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mM Glucose | |||
| 10mM NaN3 | |||
| 15-ml conical tubes (BD) | |||
| 16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD) | |||
| 30% Sucrose Solution | |||
| 35mm Petri Dishes (BD) | |||
| 4% Paraformaldehyde | |||
| 50- m cell filters (Celltrics) | |||
| 5-ml syringes (BD) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector) | |||
| Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution | |||
| Collagenase type I (Sigma) | |||
| Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) | |||
| Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation) | |||
| Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55 | |||
| Drierite | |||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher) | |||
| Glucose Oxidase 1000u/ml | |||
| Levamisole (Vector) | |||
| Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ) | |||
| Normal Horse Serum (Vector) | |||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) | |||
| Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+) | |||
| Plastic Slide Box (holds 100 slides) | |||
| Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable) | |||
| Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) | |||
| Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) | |||
| Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher) | |||
| Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon) | |||
| Tween20, SigmaUltra (Sigma) | |||
| Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) | |||
| Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector) | |||
| Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) |
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
