プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Summary

我々は、開発中の主要な造血器官として胎盤を同定した。我々はその造血幹細胞（HSC）が生成され、ユニークな微環境のニッチの胎盤で展開されている両方とも発見。ここで、我々はマウス胎盤における造血幹細胞の分離と可視化に必要な実験手法を説明します。

Abstract

造血幹細胞（HSC）は、自己更新し、個々の生涯を通して血液系統のすべての細胞型を生成する機能を持っている。すべての造血幹細胞は、それらのプールサイズは自己複製細胞分裂によって維持され、その後、胚発生時に出現する。多くの解剖学的部位が胎児の造血中に参加するとHSCの開発の過程を調節する造血幹細胞との重要な発達のイベントの解剖学的起源を特定することはややこしくなっている。最近、我々は造血幹細胞がユニークな微環境のニッチ（スゲカス、ら、2005、ロードス、ら2008）で生成し、展開されている主要な造血器官として胎盤を同定した。その結果、胎盤は、彼らの出現と初期の展開時の造血幹細胞の重要な源です。

この記事では、我々はそれぞれ、造血幹細胞および胎盤におけるHSCプールの大きさのピークの開始の発達段階に対応するE10.5からマウス胎盤の分離およびE12.5胚の解剖の技術を、示す。さらに、我々はフローサイトメトリーまたは機能アッセイで使用するための単一細胞懸濁液中に胎盤組織の酵素的および機械的解離のために最適化されたプロトコルを提示する。我々は、胎盤の単細胞懸濁液のためのコラゲナーゼの使用は、造血幹細胞の十分な収量を示すことを発見した。胎盤からHSC収量に影響を与える重要な要因は、前に機械的解離の度合い、及び酵素処理、の期間です。

我々はまた彼らの正確な細胞のニッチにおける免疫組織化学によって開発造血幹細胞の可視化のための固定凍結胎盤組織切片の調製のためのプロトコルを提供しています。造血特異的な抗原はパラフィン包埋切片の準備中に保持されていないとして、我々は日常的に胎盤造血幹細胞および前駆細胞をローカライズするための固定凍結切片を使用してください。

Protocol

1。胚の除去と胎盤切開

1. 開始するには、胚が最初に妊娠した母獣から分離する必要があります。
2. 動物は、承認された手順に従って安楽死させる - 私たちのケースで我々は、イソフルラン麻酔薬の致死量を使用するつもりです
3. 最初に、エタノールで腹をスプレーし、ハサミで小さな切開を行います。
4. 腹部を明らかにし、腹膜を切り開くために両手で皮膚を離れて引き裂く。
5. 鉗子で、子宮角をピックアップし、それぞれの先端にはさみを使用してそれらを収集する。 PBSと氷の上で場所で満たされたペトリ皿の子宮角に置きます。また、胎盤を分離する前にPBSで数回洗浄してください。我々は現在、胎盤を分離することができます。
6. two鉗子で、慎重に胚のconceptusesを周囲の子宮内膜組織を離れて剥離を開始。これはその後の解剖の手順を複雑にするので一つは、胚への構造的な損傷を与えていない穿刺またはそうでなければ注意する必要があります。
7. 氷上でPBSで新しいペトリ皿の中で孤立conceptusesを置き、すべてのconceptusesが子宮内膜から解放されるまで続けます。
8. 顕微鏡下と離れて胎盤から脱落膜ピールtwoピンセットで配置されたPBSで新しいペトリ皿一つ受胎を転送する。脱落膜の細胞は単一細胞懸濁液およびフローサイトメトリーを妨害するため、可能な限り脱落膜の限りを削除します。滑らかな連続的な剥離動きが最良の結果を達成することをお勧めします。
9. two器官の間の接合部での胎盤から卵黄嚢を切り​​取って、そっと胎盤から卵黄嚢と卵黄血管を引き出します。注意は、特に初期の胚で、胎盤の絨毛膜板を混乱しないように注意してください。
10. 注意深くピンセットと相互に臍帯と胎盤の絨毛膜板を保持し、離れて胎盤から臍帯と接続されている胚を引き出します。
11. 単一細胞懸濁液の調製中に凝集細胞を最小限にするために胎盤の端に余分な巨大な細胞組織を削除します。
12. PBS 5パーセントFCSとし、氷の上で、そのような15 mlのファルコンチューブのような適当な容器に胎盤を収集する。解剖全ての胎盤に対して、この手順を実行します。
13. この時点で、あなたはそのような体外培養や移植のように、フローサイトメトリー、機能アッセイのための単一細胞懸濁液の調製に進むことができます、または組織の固定および最終的な免疫組織化学のために埋め込み固定冷凍ブロック用に全体胎盤を準備。

2。胎盤組織の単細胞懸濁液の調製

1. 我々は現在、FACS分析のための胎盤から単一の細胞懸濁液を生成する方法を紹介します。
2. 胎盤からの単細胞懸濁液を調製するために、機械的および酵素的解離が必要です。最初に10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液をPBSに0.1％コラゲナーゼ溶液を調製。
3. あなたがいくつあるかに応じて、胎盤にコラゲナーゼ溶液の適切なボリュームを追加します。倍胎盤のボリュームと2〜5ミリリットルの間であるボリュームをお勧めします。
4. 機械的に針3回を通じてコラゲナーゼ溶液と胎盤を継代により組織を混乱させるために5 mlのシリンジに装着した16 G針を使用してください。 18 - G針を繰り返します。
5. 45分間37℃、5％CO ₂インキュベーター内のサンプルを置きます。
6. コラゲナーゼ20 - G針を介して、通過細胞溶液、および37に、さらに45分間インキュベート℃で45分間のインキュベーション後
7. それぞれの針と22 - Gと25 Gの針を介してコラゲナーゼ、通過細胞溶液で1.5時間、総インキュベーション後の3回。
8. 新しい15 mlのファルコンチューブに接続されている50μmのフィルターを通してサンプルをフィルタリングする、4℃でPBS 5パーセントFCSと遠心機で洗う℃で5分間300℃× gで
9. この時点で、我々は、FACS分析または機能性アッセイに適した単一の細胞懸濁液を持っている。

3。凍結切片用組織の固定

1. すぐにそれぞれの胚から胎盤を分離した後、それらは寒い1X PBSに配置されます。通常は96ウェルプレートは、若い胎盤（E8.5 - 11.5）に適していますが、古い胎盤で、E12.5と古いが、24ウェルプレートの方が便利かもしれません。
2. それぞれの胎盤がよく新鮮な融解4パーセントparaformaldahydeまたはPFAで満たされた新たに転送されます。 E12.5胎盤の場合、組織は手で新しいウェルに移動されますが、E10.5のために、ピペットで慎重にPBSを除去し、PFAを追加することができます。それは、胎盤が完全に組織の年齢やサイズに応じて、4℃で2〜4時間浸漬されていることが重要です。
3. 30％ショ糖に組織を移し、あるいは組織が非常に小さく、壊れやすい場合は、PFAを吸引し、直接ショ糖を加える。この段階では、胎盤は、溶液中でフローティングされます。組織は、4℃で一晩滞在しましょう​​℃に
4. 30％ショ糖で一晩ステップの後、組織は最終的に適切な凍結保存を示すウェルの底に沈むはず。ショ糖溶液の半分を削除して、OCTでボリュームを交換し、℃で1-2時間を4に戻って組織を置く。これは、OCTの浸透を容易にします。
5. それを埋め込むことができる、その後、1時間に100％OCTに組織を移す。

4。固定組織の埋め込み

1. 適切な組織の識別（ショーの例の金型）のラベルは、プラスチック金型。
2. OCTのソリューションからティッシュを引き出して、下に向け臍帯側と円盤状の胎盤を向きや慎重に確実に圧力をリリースする前に、前後に刃を移動するために確実にきれいなカミソリの刃でスライスして半分に胎盤を切るさらにカット。胎盤は、後に胎盤造血幹細胞を可視化するために最善prientationを達成するために半分にカットされます。
3. 金型の底面と接触する面取り部と金型の下部に片足胎盤の半分。残りの半分のための新しい金型を繰り返します。 E10.5胎盤の場合は、両方の半分は、同じテクニックを使用して、同じ金型に配置されることがあります。
4. 金型にOCTを注ぐときに、それは正しい方向に胎盤を維持することが困難な場合があります。鉗子で組織の半分を保持することによって場所に胎盤を固定します。徐々に金型内にOCTのソリューションを注ぎ、気泡を生成することは避けてください。 E10.5胎盤の場合は、鉗子によって1つの組織の半分をホールドし、鉗子の外側に対して、他の組織の半分を置きます。ゆっくりとしてE12.5胎盤で説明したOCTのソリューションを注ぐ。
5. 金型がOCTでいっぱいになると、すぐにドライアイスの上に金型を配置、OCTは組織を凍結白いフラッシュを向けるだろう
6. DRIERITEを含む小さなビニール袋に金型を配置し、直ちに-80℃の冷凍庫で保管してください。

Discussion

このプロトコールに記載される実験手順は、胎盤組織と造血幹細胞や前駆細胞の分離と可視化が可能になります。胎児の発育を通して胎盤や他の胎児の造血臓器における造血幹細胞の予想される細胞の収量と数に関する包括的な概要については、我々はスゲカスらを参照してください。 2005年。胎盤で造血幹細胞および他の造血細胞の開発のローカライズのために我々はローズ、らを参照してください。 2008

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)