Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Summary

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Abstract

Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial.

Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático.

Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.

Protocol

1. Remoção do embrião e dissecção da placenta

1. Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes.
2. Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados - no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano
3. Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura.
4. Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio.
5. Com uma pinça, pegue o cornos uterinos e recolhê-las usando uma tesoura em cada extremidade distal. Coloque o cornos uterinos em uma placa de petri preenchida com PBS e colocar no gelo. Além disso, lembre-se de lavar várias vezes com PBS antes de isolar a placenta. Agora podemos isolar a placenta.
6. Com duas pinças, comece a descascar cuidadosamente o tecido endometrial em torno do embrião conceptos. Deve-se ter cuidado para não furar ou não causar danos estruturais aos embriões, pois isso irá complicar a dissecção passos subseqüentes.
7. Coloque o conceptos isoladas numa placa de Petri novo com PBS sobre o gelo e continuar até que todos os conceptos foram libertados do endométrio.
8. Transferência de um concepto para uma nova placa de Petri com PBS colocado sob o microscópio e com duas pinças de descascar a decidua longe da placenta. Remover o máximo do possível decídua como células decidua irá interferir com a suspensão de uma única célula e citometria de fluxo. Um movimento contínuo suave peeling é recomendado para alcançar os melhores resultados.
9. Cortar o saco vitelino longe da placenta na junção entre os dois órgãos e puxe o saco vitelino e vasos vitelínico longe da placenta. Cuidados devem ser tomados para não perturbar a placa coriônica da placenta, especialmente com embriões.
10. Cuidadosamente segurando a placa coriônica da placenta com um par de fórceps e do cordão umbilical com outro, puxa o cordão umbilical e embrião ligado longe da placenta.
11. Remover o tecido celular excesso de gigante nas bordas da placenta, a fim de minimizar a aglutinação das células durante a preparação de uma única célula de suspensão.
12. Recolher a placenta em um recipiente apropriado, como um tubo Falcon de 15 ml, com PBS 5% FCS e no gelo. Faça isso para todas as placentas dissecados.
13. Neste ponto, você pode prosseguir com a preparação de uma suspensão de uma única célula de citometria de fluxo, ensaios funcionais, tais como a cultura in vitro ou transplante, ou preparar placenta inteira para fixação do tecido e bloco congelado fixo incorporação de imuno-histoquímica eventual.

2. Preparação de uma única célula de suspensão de tecido placenta

1. Vamos agora mostrar como gerar uma suspensão única célula da placenta para análise FACS.
2. Para preparar uma suspensão única célula da placenta, mecânica e dissociação enzimática é necessária. Primeiro preparar uma solução de colagenase 0,1% em PBS com 10% SFB e 1% de solução a penicilina / estreptomicina.
3. Adicionar um volume adequado de solução de colagenase a placentas, dependendo de quantos você tem. Um volume que é o dobro do volume de placenta e entre 2-5ml é recomendado.
4. Use uma agulha de 16 G montado em uma seringa de 5 ml para mecanicamente perturbar o tecido por passaging a solução de colagenase e da placenta através da agulha 3 vezes. Repita com uma agulha de 18-G.
5. Colocar a amostra a 37 ° C, 5% incubadora de CO ₂ por 45 minutos.
6. Após a incubação de 45 minutos em colagenase, a passagem da célula solução através de uma agulha de 20 G, e incubar por mais 45 minutos, em 37 ° C.
7. Após a incubação 1,5 hr total em colagenase, a passagem da célula solução a 22-G e 25-G agulhas 3 vezes com cada agulha.
8. Filtrar a amostra através de um filtro 50 mícrons anexado a um novo tubo Falcon de 15 ml, lavar com PBS FCS 5% e centrifugar a 4 ° C durante 5 minutos a 300 × g.
9. Neste ponto, temos uma única célula de suspensão adequado para FACS análise ou ensaios funcionais.

3. Fixação de tecidos para as secções congeladas

1. Imediatamente após o isolamento da placenta de cada embrião, eles são colocados no frio 1X PBS. Normalmente, uma placa de 96 poços funciona melhor para placentas jovens (E8.5-11.5), mas com placentas mais velhos, E12.5 e mais velhos, uma placa de 24 poços pode ser mais conveniente.
2. Cada placenta é transferido para um novo poço cheio de recém descongelados paraformaldahyde 4% ou PFA. Para E12.5 placentas, o tecido é movido para um novo poço com a mão, mas para o E10.5 você pode remover o PBS cuidadosamente com uma pipeta e adicione o PFA. É importante que a placenta está totalmente imersa por 2-4 horas a 4 ° C, dependendo da idade e tamanho do tecido.
3. Transferir o tecido em sacarose 30%, ou se os tecidos são muito pequenos e frágeis, aspirar o PFA e adicione a sacarose diretamente. Nesta fase, as placentas estará flutuando em solução. Deixe os tecidos pernoite a 4 ° C.
4. Após a etapa durante a noite em sacarose 30%, os tecidos devem em última instância, desceria ao fundo do poço, indicativo de criopreservação apropriado. Retire metade da solução de sacarose e substituir o volume com outubro e coloque o tecido de volta em 4 ° C por 1-2 horas. Isso facilita a penetração de outubro
5. Transfira o tecido para outubro 100% por 1 hora, após o que pode ser incorporado.

4. Incorporação do tecido fixado

1. Moldes de plástico com etiqueta de identificação de tecido apropriado (exemplo molde show).
2. Puxe o tecido para fora da solução outubro e cortar pela metade a placenta orientando a placenta em forma de disco com o lado do cordão umbilical para baixo e, cuidadosamente, cortando com uma lâmina limpa certificando-se de mover a lâmina frente e para trás antes de liberar a pressão para garantir um mesmo corte. A placenta é cortado ao meio para alcançar os melhores prientation mais tarde visualizar os HSCs placentária.
3. Coloque metade placenta outra na parte inferior do molde com a borda de corte em contato com a superfície inferior do molde. Repita o procedimento com um novo molde para a outra metade. Para E10.5 placentas, ambas as metades podem ser colocados no mesmo molde usando a mesma técnica.
4. Quando vazar outubro no molde, pode ser difícil manter o placentas na orientação correta. Assegurar a placenta no lugar, segurando a metade do tecido com uma pinça. Lentamente, deitar solução outubro no molde e evitar a produção de todas as bolhas. Para E10.5 placentas, segure uma metade do tecido por uma pinça e descansar a metade outro tecido contra a parte externa do fórceps. Lentamente, deitar outubro solução como descrito para E12.5 placentas.
5. Uma vez que o molde é preenchido com outubro, rapidamente colocar o molde em gelo seco, a OCT vai virar flash branco congelamento do tecido
6. Coloque o molde em um pequeno saco de plástico contendo Drierite e imediatamente armazenar no freezer -80 ° C.

Discussion

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)