Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Summary

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Abstract

Hematopoietische stamcellen (HSC's) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van alle celtypen van het bloed lijnen gedurende het hele leven van een individu. Alle HSCs ontstaan ​​tijdens de embryonale ontwikkeling, waarna de pool grootte wordt onderhouden door zelf-vernieuwing celdelingen. Het identificeren van de anatomische oorsprong van HSC en de kritische ontwikkeling gebeurtenissen reguleren van het proces van HSC ontwikkeling is ingewikkeld als veel lokalisaties deel te nemen tijdens de foetale hematopoiesis. Recent identificeerden we de placenta als een belangrijk orgaan waar hematopoietische HSC's worden gegenereerd en uitgebreid in een unieke microenvironmental niches (Gekas, et al. 2005, Rhodos, et al. 2008). Bijgevolg is de placenta is een belangrijke bron van HSC tijdens hun opkomst en de eerste uitbreiding.

In dit artikel tonen we dissectie technieken voor de isolatie van murine placenta van E10.5 en E12.5 embryo's, die overeenkomen met de ontwikkelingsstadia van de inleiding van HSC en de piek in de grootte van de HSC zwembad in de placenta, respectievelijk. Daarnaast presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor enzymatische en mechanische dissociatie van placenta weefsel in de single-cell suspensie voor gebruik in de flowcytometrie of functionele assays. We hebben gevonden dat het gebruik van collagenase voor single-celsuspensie van placenta voldoende opbrengsten van HSC geeft. Een belangrijke factor die van invloed HSC opbrengst van de placenta is de mate van mechanische dissociatie voorafgaand aan, en de duur van, enzymatische behandeling.

We bieden ook een protocol voor de bereiding van vaste-ingevroren placenta weefsel secties voor de visualisatie van de ontwikkeling van HSC door middel van immunohistochemie in hun precieze cellulaire niches. Als hematopoietische specifieke antigenen zijn niet bewaard gebleven tijdens de bereiding van paraffine ingebedde coupes, we routinematig gebruik van vaste vriescoupes voor het lokaliseren van de placenta HSCs en voorouders.

Protocol

1. Embryo verwijdering en placenta dissectie

1. Om te beginnen, moeten embryo's eerst worden geïsoleerd van zwangere dammen.
2. Dieren worden gedood volgens goedgekeurde procedures - in ons geval gaan we een dodelijke dosis van het verdovingsmiddel isofluraan gebruiken
3. De eerste, spray de buik met ethanol en een kleine incisie met een schaar.
4. Afscheuren van de huid met beide handen op de buik bloot te leggen en open snijden het buikvlies.
5. Met een pincet, pak de baarmoeder hoornen en verzamel ze met een schaar aan elk distale einde. Plaats de baarmoeder hoorns in een petrischaal gevuld met PBS en leg ze op ijs. Vergeet ook niet om een ​​paar keer wassen met PBS voor het isoleren van de placenta. We kunnen nu isoleren de placenta.
6. Met twee tang, beginnen voorzichtig afpellen van het endometrium weefsel rondom de embryo conceptuses. Men moet oppassen niet te doorboren of anderszins toebrengen structurele schade aan de embryo's, want dit zal bemoeilijken latere dissectie stappen.
7. Plaats het geïsoleerde conceptuses in een nieuwe petrischaal met PBS op ijs en blijven totdat alle conceptuses zijn bevrijd van het baarmoederslijmvlies.
8. Overdracht een conceptie van een nieuwe petrischaal met PBS onder de microscoop en met twee tangen schil van de decidua weg van de placenta. Verwijder zoveel mogelijk van de decidua mogelijk als decidua cellen zullen interfereren met single-cell vering en flowcytometrie. Een vloeiende continu-peeling beweging wordt aanbevolen om de beste resultaten te bereiken.
9. Weggesneden de dooierzak van de placenta op de kruising tussen de twee organen en zachtjes weg te trekken van de dooierzak en vitelline vaartuigen van de placenta. Zorg ervoor dat u niet aan de chorion plaat van de placenta te verstoren, in het bijzonder met vroege embryo's.
10. Zorgvuldig te houden van de chorion plaat van de placenta met een pincet en de navelstreng met een ander, trek aan de navelstreng en de bijgevoegde embryo weg van de placenta.
11. Verwijder overtollig gigantische cel weefsel aan de randen van de placenta, om cellen klonteren tijdens de bereiding van de single-celsuspensie te minimaliseren.
12. Verzamel de placenta in een geschikte container, zoals een 15-ml Falcon buis, met PBS +5% FCS en op ijs. Doe dit voor alle placenta's ontleed.
13. Op dit punt, kunt u doorgaan met de voorbereiding van een single-cell suspensie voor flowcytometrie, functionele testen, zoals in vitro cultuur of transplantatie, of bereid gehele placenta voor weefsel fixatie en vaste diepgevroren blok inbedding voor eventuele immunohistochemie.

2. Voorbereiding van de single-celsuspensie van placenta weefsel

1. We zullen nu laten zien hoe je een enkele celsuspensie van de placenta voor de FACS-analyse te genereren.
2. Ter voorbereiding op een enkele celsuspensie van de placenta, mechanische en enzymatische dissociatie is vereist. Prepareert u eerst een 0,1%-oplossing Collagenase in PBS met 10% FCS en 1% penicilline / streptomycine-oplossing.
3. Voeg een geschikt volume van collagenase oplossing om de placenta's, afhankelijk van hoeveel je hebt. Een volume dat het dubbele is van de placenta volume en tussen de twee-5ml wordt aanbevolen.
4. Gebruik een 16-G naald gemonteerd op een 5-ml-spuit op het weefsel mechanisch verstoren door passage van de collagenase oplossing en placenta door de naald 3 keer. Herhaal dit met een 18-G naald.
5. Het monster wordt in een 37 ° C, 5% CO ₂ incubator gedurende 45 minuten.
6. Na de 45 minuten incubatie in collagenase, passage de cel oplossing door een 20-G naald, en incubeer gedurende een extra 45 minuten, in 37 ° C.
7. Na de 1,5 uur incubatie in totaal collagenase, passage de cel oplossing door 22-G en de 25-G naalden drie keer met elke naald.
8. Filtreer het monster door een 50-um filter gekoppeld aan een nieuwe 15-ml Falcon buis, wassen met PBS +5% FCS en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 300 x g.
9. Op dit punt hebben we een enkele celsuspensie die geschikt zijn voor FACS-analyse of functionele assays.

3. Weefsel Fixatie voor vriescoupes

1. Onmiddellijk na het isoleren van de placenta uit elk embryo, worden ze in koud 1X PBS. Meestal een 96-wells plaat het beste werkt voor jonge placenta (E8.5-11.5), maar met oudere placenta's, E12.5 en ouder, een 24-wells plaat kan handiger.
2. Elke placenta is ondergebracht in een nieuwe goed gevuld met vers ontdooid 4% paraformaldahyde of PFA. Voor de E12.5 placenta's, is het weefsel verplaatst naar een nieuw goed met de hand, maar voor de E10.5 kan je voorzichtig verwijderen van de PBS met een pipet en voeg de PFA. Het is belangrijk dat de placenta volledig is ondergedompeld gedurende 2-4 uur bij 4 ° C, afhankelijk van de leeftijd en de grootte van het weefsel.
3. Breng de weefsel in 30% sucrose, of als de weefsels zijn erg klein en broos, zuigen de PFA en direct toe te voegen de sucrose. In dit stadium zal de placenta te zweven in oplossing. Laat de weefsels overnachten bij 4 ° C.
4. Na de nacht stap in 30% sucrose, moeten de weefsels uiteindelijk zinken naar de bodem van de put, indicatief voor een goede cryopreservatie. Verwijder de helft van de sucrose-oplossing en vervang het volume met LGO en terug te plaatsen van het weefsel in de 4 ° C gedurende 1-2 uur. Dit vergemakkelijkt oktober penetratie.
5. Overdracht van het weefsel tot 100% LGO voor een uur, waarna het kan worden ingebed.

4. Inbedden van de Vaste Tissue

1. Label plastic mallen met de juiste weefsel identificatie (tonen bijvoorbeeld schimmels).
2. Trek het weefsel uit de LGO-oplossing en snijd de placenta in tweeën gedeeld door het oriënteren van de schijfvormige placenta met de navelstreng kant naar beneden en zorgvuldig snijden met een schoon scheermesje en zorg ervoor dat het blad heen en weer voor het vrijgeven van de druk om ervoor te zorgen een nog te snijden. De placenta wordt gesneden in de helft om de beste prientation bereiken later visualiseren van de placenta HSC.
3. Plaats een placenta half op de bodem van de vorm met de gesneden kant in contact komen met de onderkant van de mal. Herhalen met een nieuwe mal voor de andere helft. Voor E10.5 placenta's, kunnen beide helften worden geplaatst in dezelfde mal met behulp van dezelfde techniek.
4. Bij het gieten oktober in de mal, kan het moeilijk zijn om de placenta te houden in de juiste richting. Zet de placenta op zijn plaats door die de weefsel half met een tang. Giet langzaam oktober oplossing in de vorm en voorkomen dat de productie van eventuele luchtbellen. Voor E10.5 placenta's, houdt u een weefsel half door de tang en de rest van de ander weefsel half tegen de buitenkant van de tang. Giet langzaam oktober oplossing zoals beschreven voor E12.5 placenta's.
5. Zodra de mal is gevuld met oktober, snel de matrijs plaats op droog ijs, zal de LGO-turn witte flits bevriezen van de weefsel
6. Plaats de vorm in een klein plastic zakje met Drierite en onmiddellijk op te slaan in de -80 ° C vriezer.

Discussion

De experimentele procedures beschreven in dit protocol zal zorgen voor isolatie en visualisatie van placenta weefsel en hematopoietische stamcellen en progenitorcellen. Voor een uitgebreide samenvatting over de verwachte opbrengst en het aantal cellen van HSC in de placenta en andere foetale hematopoietische organen gedurende de foetale ontwikkeling verwijzen we naar Gekas, et al.. 2005. Voor het lokaliseren van het ontwikkelen van HSC en andere hematopoietische cellen in de placenta verwijzen we naar Rhodos, et al.. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)