Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Summary

Nous avons identifié le placenta comme un organe majeur lors du développement hématopoïétique. Nous avons constaté que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à la fois générées et développées dans le placenta dans des niches uniques microenvironnementales. Ici, nous décrivons des techniques expérimentales nécessaires à l'isolement et la visualisation des CSH dans le placenta de souris.

Abstract

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la capacité de s'auto-renouveler et de générer tous les types de cellules des lignées de sang à travers la vie d'un individu. Tous les CSH apparaissent pendant le développement embryonnaire, après quoi leurs dimensions de la piscine est maintenue par l'auto-renouvellement des divisions cellulaires. Identifier l'origine anatomique des CSH et les événements critiques de développement régulation du processus de développement HSC a été compliqué car beaucoup de sites anatomiques participer durant l'hématopoïèse fœtale. Récemment, nous avons identifié le placenta comme un organe majeur où les CSH hématopoïétiques sont générées et élargi dans des niches uniques microenvironnementales (Gekas, et al 2005, à Rhodes, et al 2008). En conséquence, le placenta est une source importante de CSH au cours de leur émergence et l'expansion initiale.

Dans cet article, nous montrons les techniques de dissection pour l'isolement du placenta de souris E10.5 E12.5 et embryons, ce qui correspond aux étapes de développement de l'initiation des CSH et le pic de la taille de la piscine HSC dans le placenta, respectivement. En outre, nous présentons un protocole optimisé pour la dissociation enzymatique et mécanique du tissu placentaire dans une seule cellule de suspension pour une utilisation en cytométrie en flux ou des tests fonctionnels. Nous avons constaté que l'utilisation de la collagénase pour une seule cellule de suspension du placenta donne des rendements suffisants de CSH. Un facteur important affectant le rendement HSC du placenta est le degré de dissociation mécanique avant, et la durée de traitement enzymatique.

Nous fournissons également un protocole pour la préparation de surgelés fixe des coupes de tissus placentaires pour la visualisation de développer CSH par immunohistochimie dans leurs niches précises cellulaire. Comme hématopoïétiques antigènes spécifiques ne sont pas conservés lors de la préparation des sections paraffine, nous utilisent couramment fixes coupes congelées pour localiser les CSH et les progéniteurs placentaire.

Protocol

1. Retrait de l'embryon et du placenta de dissection

1. Pour commencer, les embryons doivent d'abord être isolés à partir des barrages enceinte.
2. Les animaux sont euthanasiés selon les procédures approuvées - dans notre cas nous allons utiliser une dose létale de l'isoflurane anesthésie
3. Tout d'abord, le ventre de pulvérisation avec de l'éthanol et de faire une petite incision avec une paire de ciseaux.
4. Arrachez la peau avec les deux mains pour découvrir l'abdomen et à ciel ouvert le péritoine.
5. Avec des pinces, ramasser les cornes utérines et de recueillir leur aide de ciseaux à chaque extrémité distale. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri remplie de PBS et placer sur la glace. Aussi, n'oubliez pas de laver plusieurs fois avec du PBS avant d'isoler le placenta. Nous pouvons maintenant isoler le placenta.
6. Avec deux pinces, commencent attentivement retirant le tissu de l'endomètre entourant le conceptus embryon. Il faut être prudent à ne pas percer ou autrement infliger des dommages structurels à des embryons, car cela compliquerait les étapes ultérieures de dissection.
7. Placez le conceptus isolés dans un nouveau plat de pétri avec du PBS sur la glace et continuer jusqu'à ce que tous conceptus ont été libérés de l'endomètre.
8. Transfert d'une conceptus un nouveau plat de pétri avec du PBS placé sous le microscope et avec deux pinces éplucher les decidua loin de la barrière placentaire. Enlevez autant de la caduque que possible que les cellules decidua va interférer avec une seule cellule de suspension et de cytométrie en flux. Un mouvement continu lisse peeling est recommandé de réaliser les meilleurs résultats.
9. Couper le sac vitellin loin de le placenta à la jonction entre les deux organes et tirez doucement le sac vitellin et les vaisseaux vitellins loin de la barrière placentaire. Il faut prendre soin de ne pas perturber la plaque choriale du placenta, surtout avec des embryons précoces.
10. Soigneusement tenant la plaque choriale du placenta avec une paire de pinces et le cordon ombilical avec un autre, tirez le cordon ombilical et de l'embryon attachée loin de la barrière placentaire.
11. Retirer l'excès de tissu à cellules géantes sur les bords du placenta afin de minimiser les cellules agglutination pendant la préparation de la suspension à cellule unique.
12. Recueillir le placenta dans un récipient approprié, tel qu'un tube de 15 ml Falcon, avec PBS% FCS et 5 sur la glace. Faites cela pour tous les placentas disséqués.
13. À ce stade, vous pouvez soit procéder à la préparation d'une suspension à cellule unique pour la cytométrie de flux, des tests fonctionnels, tels que la culture in vitro ou la transplantation, ou de préparer le placenta entier pour la fixation des tissus et fixes bloc congelé intégration éventuelle pour l'immunohistochimie.

2. Préparation de unicellulaire suspension de tissu placentaire

1. Nous allons maintenant vous montrer comment générer une suspension cellulaire unique à partir de placenta pour analyse FACS.
2. Pour préparer une suspension cellulaire unique du placenta, la mécanique et de la dissociation enzymatique est nécessaire. D'abord préparer une solution de collagénase 0,1% dans PBS avec 10% de SVF et 1% d'une solution de pénicilline / streptomycine.
3. Ajouter un volume approprié de solution de collagénase à l'placentas, selon le nombre que vous avez. Un volume qui est le double du volume du placenta, et entre 2-5ml est recommandée.
4. Utilisez une aiguille 16 G monté sur une seringue de 5 ml mécaniquement à détruire le tissu par passage de la solution de collagénase et de placenta par l'aiguille 3 fois. Répétez l'opération avec une aiguille 18-G.
5. Placer l'échantillon dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur pendant 45 minutes.
6. Après l'incubation de 45 minutes dans de la collagénase, le passage de la solution de la cellule grâce à une aiguille 20 G, et incuber pendant 45 minutes supplémentaires, à 37 ° C.
7. Après les heures d'incubation 1,5 total dans la collagénase, le passage de la solution par le biais de cellules de 22 G et 25 G-aiguilles 3 fois avec chaque aiguille.
8. Filtrer l'échantillon à travers un filtre de 50 um à un nouveau 15 ml de tube Falcon, laver avec du PBS 5% SVF et centrifuger à 4 ° C pendant 5 minutes à 300 x g.
9. À ce stade, nous avons une suspension cellulaire unique adapté à l'analyse FACS ou des tests fonctionnels.

3. Fixation des tissus pour les coupes congelées

1. Immédiatement après avoir isolé le placenta de chaque embryon, elles sont placées dans du PBS 1X froid. Habituellement une plaque de 96 puits qui fonctionne le mieux pour les placentas jeunes (E8.5-11.5), mais avec plus de placentas, E12.5 et plus, une plaque de 24 puits peut être plus pratique.
2. Chaque placenta est transféré dans un nouveau puits rempli de 4% fraîchement dégelé paraformaldahyde ou PFA. Pour la E12.5 placentas, le tissu est déplacé vers un nouveau puits à la main, mais pour le E10.5 vous pouvez retirer le CPE soigneusement avec une pipette et ajoutez les PFA. Il est important que le placenta est complètement immergé pendant 2-4 heures à 4 ° C, selon l'âge et la taille des tissus.
3. Transférer le tissu dans 30% de sucrose, ou si les tissus sont très petits et fragiles, aspirer la PFA et ajouter du saccharose directement. A ce stade, les placentas seront flottants en solution. Laissez les tissus nuit à 4 ° C.
4. Après l'étape de nuit dans 30% de sucrose, les tissus devrait finalement couler au fond du puits, indicatif de cryoconservation approprié. Retirer la moitié de la solution de saccharose et de remplacer le volume avec les PTOM et placer le tissu de retour à 4 ° C pendant 1-2 heures. Cela facilite la pénétration octobre
5. Transfert le tissu à 100% pour octobre 1 heure, après quoi il peut être incorporé.

4. Intégrer le tissu fixe

1. Moules étiquette en plastique avec une identification appropriée des tissus (par exemple la moisissure spectacle).
2. Tirez le tissu de la solution PTOM et coupé le placenta dans la moitié en orientant le placenta en forme de disque avec le côté du cordon ombilical vers le bas et soigneusement couper avec une lame de rasoir propre en veillant à déplacer la lame avant et en arrière avant de relâcher la pression pour assurer une même coupe. Le placenta est coupé en deux pour obtenir le meilleur prientation au plus tard, de visualiser les CSH placentaires.
3. Moitié du placenta Placer un au fond du moule avec le bord coupé en contact avec la surface du fond du moule. Répétez l'opération avec un nouveau moule pour l'autre moitié. Pour E10.5 placentas, les deux moitiés peuvent être placés dans le même moule en utilisant la même technique.
4. Lors du coulage PTOM dans le moule, il peut être difficile de garder le placenta dans le bon sens. Fixez le placenta en place par la tenue de la moitié des tissus avec une pince. Verser lentement la solution PTOM dans le moule et éviter de produire des bulles. Pour E10.5 placentas, maintenez la moitié des tissus par des pinces et le repos de la moitié des autres tissus contre l'extérieur de la pince. Verser lentement la solution PTOM décrit pour E12.5 placentas.
5. Une fois le moule est rempli avec des PTOM, de placer rapidement le moule sur la glace sèche, les PTOM se tourneront flash blanc geler le tissu
6. Placer le moule dans un petit sac en plastique contenant Drierite et immédiatement dans le magasin de congélateur à -80 ° C.

Discussion

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole permettra à l'isolement et la visualisation des tissus placentaires et souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices. Pour un résumé complet sur le rendement attendu et cellulaires nombre de CSH dans le placenta et les autres organes hématopoïétiques fœtales à travers le développement du fœtus nous nous référons à Gekas, et al. 2005. Pour la localisation des CSH en développement et d'autres cellules hématopoïétiques dans le placenta nous nous référons à Rhodes, et al. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)