Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Summary

Vi har identifierat moderkakan som en viktig hematopoetiska organ under utvecklingen. Vi fann att hematopoetiska stamceller (HSCs) är både genereras och expanderat i moderkakan i unika microenvironmental nischer. Här beskriver vi experimentella tekniker som krävs för isolering och visualisering av HSCs i musen moderkakan.

Abstract

Hematopoetiska stamceller (HSCs) har förmågan att själv förnya och generera alla celltyper i blodet linjerna under hela livslängden för en individ. Alla HSCs uppstår under fosterutvecklingen, varefter deras pool storlek upprätthålls av själva förnya celldelningar. Identifiera anatomiska ursprung HSCs och den kritiska utvecklingsmässiga händelser som reglerar processen med HSC utveckling har komplicerat som många anatomiska ställen delta under fosterstadiet blodbildningen. Nyligen identifierade vi moderkakan som ett stort hematopoetiska organ där HSCs genereras och expanderade i unika microenvironmental nischer (Gekås, et al 2005, Rhodos, et al 2008). Därför är moderkakan en viktig källa till HSCs under deras uppkomst och inledande expansion.

I den här artikeln visar vi dissektion tekniker för isolering av murina moderkakan från E10.5 och E12.5 embryon, motsvarande utvecklingsstadier för insättande av HSCs och toppen i storlek HSC poolen i moderkakan, respektive. Dessutom presenterar vi ett optimerat protokoll för enzymatisk och mekanisk dissociation av moderkakan vävnad till encelliga suspension för användning i flödescytometri eller funktionella analyser. Vi har funnit att användningen av kollagenas för encelliga suspension av moderkakan ger tillräcklig avkastning av HSCs. En viktig faktor som påverkar HSC avkastningen från moderkakan är graden av mekaniska dissociation före, och varaktighet, enzymatisk behandling.

Vi erbjuder även ett protokoll för beredning av fast frusna moderkakan vävnadssnitt för visualisering för att utveckla HSCs genom immunhistokemi i deras exakta cellulära nischer. Som hematopoetiska specifika antigener inte bevaras under beredning av paraffininbäddade sektioner, vi använder rutinmässigt fast frysta snitt för att lokalisera moderkakan HSCs och stamceller.

Protocol

1. Embryo borttagning och moderkakan dissektion

1. Till att börja med måste embryon först isoleras från gravida dammar.
2. Djur avlivas i enlighet med godkända förfaranden - i vårt fall kommer vi att använda en dödlig dos av bedövningsmedel isofluran
3. Först spraya magen med etanol och göra ett litet snitt med en sax.
4. Riv bort huden med båda händerna för att avslöja buken och skära upp bukhinnan.
5. Med pincett, plocka upp livmodern horn och samla dem med en sax i varje distala änden. Placera livmodern hornen i en petriskål fylld med PBS och lägg på is. Kom också ihåg att tvätta flera gånger med PBS innan isolera moderkakan. Vi kan nu isolera moderkakan.
6. Med två pincett, börja försiktigt skalar bort endometrial vävnaden som omger embryot conceptuses. Man bör vara noga med att inte punktera eller på annat sätt orsaka strukturella skador på embryon, eftersom detta kommer att komplicera ytterligare dissektion steg.
7. Placera isolerade conceptuses i en ny petriskål med PBS på is och fortsätta tills alla conceptuses har befriats från livmoderslemhinnan.
8. Överför en Conceptus till en ny petriskål med PBS placeras under mikroskop och med två pincett skala decidua bort från moderkakan. Ta bort så mycket av decidua som möjligt decidua celler kommer att störa encelliga fjädring och flödescytometri. En smidig kontinuerlig peeling rörelse rekommenderas för att uppnå bästa resultat.
9. Skär gulesäcken borta från moderkakan i korsningen mellan de två organen och dra försiktigt gulesäcken och vitelline fartyg bort från moderkakan. Försiktighet bör iakttas att inte störa chorionic plattan av moderkakan, särskilt med tidiga embryon.
10. Försiktigt hålla chorionic tallrik moderkakan med en pincett och navelsträngen med en annan, dra i navelsträngen och bifogas embryo bort från moderkakan.
11. Ta bort överflödig jätte cellvävnad vid kanterna av moderkakan för att minimera cell klumpar under beredning av encelliga suspension.
12. Samla moderkakan i en lämplig behållare, t.ex. en 15-ml Falcon rör med PBS 5% FCS och på is. Gör detta för alla dissekeras moderkakor.
13. I det här läget kan du fortsätta antingen med utarbetandet av en encelliga suspension för flödescytometri, funktionella analysmetoder såsom in vitro-kultur eller transplantation, eller förbereda hela moderkaka för mjukpapper fixering och fasta frysta blocket bädda för eventuella immunohistokemi.

2. Beredning av encelliga suspension av vävnad av moderkaka

1. Vi kommer nu att visa dig hur du skapar en enda cell avstängning från moderkakan för FACS analys.
2. För att förbereda en enda cell avstängning från moderkakan, mekanisk och enzymatisk dissociation krävs. Först förbereder en 0,1% kollagenas lösning i PBS med 10% FCS och 1% Penicillin / streptomycin lösning.
3. Lägg till en lämplig volym av kollagenas lösning på moderkakor, beroende på hur många du har. En volym som är dubbelt moderkakan volym och mellan 2-5ml rekommenderas.
4. Använd en 16-G-nål monterad på en 5-ml spruta för att mekaniskt störa vävnad genom passaging den kollagenas lösningen och moderkakan genom nålen 3 gånger. Upprepa med en 18-G-nål.
5. Placera provet i en 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator i 45 minuter.
6. Efter 45 minuters inkubation i kollagenas, passage cellen lösningen genom ett 20-G-nål och inkubera under ytterligare 45 minuter i 37 ° C.
7. Efter 1,5 h totala inkubation i kollagenas, passage cellen lösning genom 22-G och 25-G-nålar 3 gånger med varje nål.
8. Filtrera provet genom ett 50-ìm filter ansluts till en ny 15-ml Falcon rör, tvätta med PBS 5% FCS och centrifugera vid 4 ° C i 5 minuter vid 300 x g.
9. På denna punkt har vi en enda cellsuspensionen lämplig för FACS-analys eller funktionella analysmetoder.

3. Mjukpapper Fixering för frysta snitt

1. Omedelbart efter att isolera moderkakan från varje embryo placeras de i kallt 1X PBS. Vanligtvis en 96-brunnar fungerar bäst för unga moderkakor (E8.5-11.5), men med äldre moderkakor, E12.5 och äldre, kan en 24-brunnar vara mer bekvämt.
2. Varje moderkakan överförs till en ny brunn fylld med färska tinade 4% paraformaldahyde eller PFA. För E12.5 moderkakor, är den vävnad flyttas till en ny brunn för hand, men för E10.5 du kan ta bort PBS försiktigt med en pipett och tillsätt PFA. Det är viktigt att moderkakan är helt nedsänkt i 2-4 timmar vid 4 ° C, beroende på ålder och storlek av vävnaden.
3. Överför vävnad till 30% sackaros, eller om vävnaderna är mycket små och sköra, aspirera PFA och tillsätt sackaros direkt. I detta skede kommer moderkakor vara flytande i lösning. Låt vävnaderna övernatta vid 4 ° C.
4. Efter den natten steg i 30% sackaros bör vävnaderna sjunker slutligen till botten av brunnen, ett tecken på god frysförvaring. Ta bort hälften av sackaroslösning och ersätta volymen med oktober och placera vävnaden tillbaka i 4 ° C i 1-2 timmar. Detta underlättar oktober penetration.
5. Överför vävnaden till 100% oktober i 1 timme, varefter det kan bäddas.

4. Bädda Fast Tissue

1. Etikett plastformar med lämplig vävnad identifiering (visa exempel mögel).
2. Dra vävnad från oktober lösningen och skär moderkakan i hälften genom att styra den skivformade moderkakan med navelsträngen nedåt och försiktigt skära med en ren rakblad och se till att flytta bladet fram och tillbaka innan du släpper trycket för att säkerställa en jämn klippning. Moderkakan halveras för att uppnå bästa prientation att senare visualisera placentapassage HSCs.
3. Placera en moderkaka halv i botten av formen med den skurna kanten i kontakt med bottenyta formen. Upprepa med en ny form för den andra halvan. För E10.5 moderkakor, kan båda halvorna placeras i samma form med samma teknik.
4. Då häller oktober i formen, kan det vara svårt att hålla moderkakor i rätt riktning. Säkra moderkakan på plats genom att hålla vävnaden hälften med pincett. Häll långsamt oktober lösning i formen och undvika att ge några bubblor. För E10.5 moderkakor, håll en vävnad hälften av pincett och vila andra vävnader halv mot utsidan av peang. Häll långsamt oktober lösning som på E12.5 moderkakor.
5. När formen är fylld med oktober, snabbt placera formen på torris, kommer oktober bli vit blixt frysa vävnaden
6. Placera formen i en liten plastpåse med Drierite och omedelbart förvara i -80 ° C frys.

Discussion

Den experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll kommer att möjliggöra isolering och visualisering av moderkakan vävnad och hematopoetiska stamceller och progenitorceller. För en uttömmande sammanfattning om förväntade cellulär avkastning och antal HSCs i moderkaka och andra fostrets hematopoetiska organ under fosterutvecklingen hänvisar vi till Gekås, et al. 2005. För lokalisering av att utveckla HSCs och andra hematopoetiska celler i moderkakan hänvisar vi till Rhodos, et al. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)