Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Summary

Biz, gelişimi sırasında büyük bir hematopoetik organ olarak plasenta tespit ettik. Biz, hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) üretilen ve benzersiz microenvironmental nişler içinde plasenta genişletilmiş iki bulundu. Burada, fare plasenta HKH'lerin izolasyonu ve görselleştirme için gerekli deneysel teknikler açıklanmaktadır.

Abstract

Hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin), kendi kendini yenileme ve bireyin ömrü boyunca kan soyların bütün hücre tipleri oluşturmak yeteneğine sahip. Tüm HKH'lerin kendi havuzu boyutu kendini sürekli yenileyen hücre bölünmeleri tarafından yapılmaktadır, bundan sonra, embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkar. HSC gelişme sürecini düzenleyen HKH'lerin ve kritik gelişimsel olayların anatomik kökenli belirlenmesi, birçok anatomik siteler fetal hematopoez sırasında katılmak olarak karmaşık olmuştur. Son zamanlarda, büyük hematopoetik bir organ olarak HKH'lerin (Gekas, ve ark 2005, Rodos, ve ark 2008) ve eşsiz microenvironmental nişler genişletilmiş plasenta belirledi. Sonuç olarak, plasenta, bunların ortaya çıkması ve ilk genişleme sırasında HKH'lerin önemli bir kaynak.

Bu makalede, biz E10.5 ve sırasıyla HKH'lerin başlatılması ve plasenta HSC havuzu boyutu zirve gelişim evreleri ile ilgili E12.5 embriyolar, fare plasentanın izolasyonu için diseksiyon teknikleri gösteriyor. Buna ek olarak, flow sitometri veya fonksiyonel testleri kullanmak için tek hücre süspansiyonu içine plasental doku enzimatik ve mekanik ayrılma için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Plasentanın tek hücre süspansiyonu için kollajenaz kullanımı HKH'lerin yeterli verimi verdiğini bulduk. Plasenta HSC verimi etkileyen önemli bir faktör, önceden mekanik ayrılma derecesi, ve enzimatik tedavi süresi.

Biz de onların hassas hücresel nişler içinde immünohistokimya HKH'lerin gelişmekte olan görselleştirme için sabit-dondurulmuş plasental doku kesitlerinde hazırlanması için bir protokol sağlar. Hematopoetik spesifik antijenler parafin bölümlerinin hazırlanması sırasında korunur olarak, rutin plasental HKH'lerin ve atalarıdır lokalize için sabit dondurulmuş bölümleri kullanabilirsiniz.

Protocol

1. Embriyo kaldırma ve plasental diseksiyonu

1. Başlamak için, embriyolarının ilk hamile barajlardan izole edilmelidir.
2. Hayvanlar onaylanmış prosedürlere göre ötenazi bizim durumumuzda ölümcül dozda anestezi izofluran kullanmak için gidiyoruz
3. İlk olarak, etanol ile karın sprey ve bir makas ile küçük bir kesi yapmak.
4. Karın ortaya çıkarmak ve periton açık kesmek için iki elinizle deri koparmak.
5. Forseps ile uterin boynuz pick up ve onları her distal sonunda makas kullanarak toplamak. PBS ve yer buz dolu bir petri rahim boynuzları yerleştirin. Ayrıca, plasenta izole önce PBS ile birkaç kez yıkamak için hatırlıyorum. Biz şimdi plasenta ayırabilirsiniz.
6. Iki forseps ile embriyo conceptuses çevreleyen endometrial doku dikkatlice uzakta soyma başlar. Bir delinme veya embriyoların yapısal hasar, aksi takdirde sonraki diseksiyonu adımları zorlaştıracaktır dikkatli olmalıdır.
7. PBS ile buz üzerinde yeni bir petri izole conceptuses yerleştirin ve tüm conceptuses endometrium kurtulmuş kadar devam ediyor.
8. PBS ile mikroskop altında ve iki forseps plasenta desidua kabuğu ile yerleştirilen yeni bir petri bir konseptus aktarın. Desidua hücreleri tek hücre süspansiyonu ve flow sitometri ile müdahale mümkün olduğunca desidua kadar çıkarın. Pürüzsüz sürekli soyma hareketi en iyi sonuçları elde etmek için tavsiye edilir.
9. Iki organ arasında kavşakta plasenta yolk kesesi uzak kesin ve nazikçe plasenta uzak yolk kesesi ve vitellin damarları çekin. Bakım, özellikle erken embriyolar, plasentanın koryonik plaka bozmak için değil alınmalıdır.
10. Forseps çifti ve başka bir ile göbek kordonu ile plasentanın koryonik plaka dikkatlice tutarak, göbek kordonunun plasenta uzak ve bağlı embriyo çekin.
11. Tek hücre süspansiyonu hazırlanması sırasında topaklanma hücre en aza indirmek için plasentanın kenarlarında aşırı dev hücre dokusu çıkarın.
12. PBS +5% FCS ve buz üzerinde, uygun bir kaba 15 ml Falcon tüp gibi, plasenta toplayın. Disseke tüm plasenta için bunu yapın.
13. Bu noktada, ya da in vitro kültür veya transplantasyon gibi flow sitometri, fonksiyonel testleri, tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması ile devam edebilirsiniz ya da doku fiksasyon ve nihai immünohistokimya için gömme sabit dondurulmuş blok için bütün plasenta hazırlamak.

2. Plasenta dokusunun tek hücre süspansiyonu hazırlanması

1. Şimdi FACS analizi için plasentanın tek bir hücre süspansiyonu nasıl oluşturmak için size gösterecektir.
2. Plasenta tek bir hücre süspansiyonu, mekanik ve enzimatik ayrılma hazırlamak için gereklidir. İlk% 10 FCS ve% 1 penisilin / Streptomisin çözüm PBS içinde% 0,1 kollajenaz solüsyon hazırlanır.
3. Kaç bağlı olarak kollajenaz çözüm uygun bir hacmi, plasenta ekleyin. Plasenta hacmi ve 2-5ml arasında iki kez hacmi önerilir.
4. 5 ml şırınga, iğne 3 kez kollajenaz çözüm ve plasenta yoluyla Pasajlanması doku mekanik bozmaya donatılmış bir 16-G iğne kullanın. 18-G bir iğne ile tekrarlayın.
5. 45 dakika boyunca 37 ° _C,% 5 CO2 inkübatör örnek yerleştirin.
6. 20 G iğne ile kollajenaz, pasajı hücre çözümü, 37, ek bir 45 dakika boyunca inkübe ° C de 45 dakika inkübasyondan sonra
7. Her bir iğne ile 22-G ve 25 G iğneler aracılığıyla kollajenaz, pasajı hücre çözümü toplam 1.5 saat inkübasyon sonra 3 kez.
8. 50 mikron filtre ile yeni bir 15 ml Falcon tüp takılı bir örnek Filtre, 4 PBS +% 5 FCS ve santrifüj ile yıkayın ° C 5 dakika boyunca 300 × g.
9. Bu noktada, biz FACS analiz ve fonksiyonel testleri için uygun tek bir hücre süspansiyonu var.

3. Dondurulmuş Bölüm Doku Fixation

1. Hemen her embriyonun plasenta izole sonra, soğuk 1X PBS yerleştirilir. Genellikle 96-plaka genç plasenta (E8.5-11.5) için en iyi çalışır, ancak büyük plasentası ile E12.5 ve yaşlı, 24 plaka daha uygun olabilir.
2. Her plasenta taze çözülmüş% 4 paraformaldahyde veya PFA ile de dolu yeni bir aktarılır. E12.5 plasenta, doku yeni bir de elle taşınır, ancak E10.5 bir pipet yardımıyla dikkatlice PBS kaldırmak ve PFA ekleyin. Plasenta doku yaşına ve büyüklüğüne göre tamamen, 4 ° C'de 2-4 saat süreyle dalmış olduğu önemlidir.
3. % 30 sukroz doku transferi, ya da dokuların çok küçük ve narin ise, PFA aspirat ve sakaroz doğrudan ekleyin. Bu aşamada, plasenta çözüm yüzen olacaktır. Dokular 4 geceleme ° C
4. % 30 sukroz gecede adım sonra, sonuçta dokuları uygun kriyoprezervasyon göstergesidir iyi alt lavabo olmalıdır. Sakaroz çözeltisini yarısını çıkarın ve OCT ile ses değiştirin ve 4 ° C'de 1-2 saat süreyle doku yerleştirmek. Bu Ekim penetrasyonu kolaylaştırır.
5. Gömülü olması, bu tarihten sonra 1 saat süreyle% 100 Ekim doku aktarın.

4. Sabit Doku gömülmesi

1. Uygun doku tanımlama ile (show örnek kalıp) Etiket plastik kalıplar.
2. OCT çözüm dokusu dışarı doğru çekin ve disk şeklindeki plasenta göbek kordonu yüzü aşağı bakacak şekilde yönlendirilmesi ve dikkatli bir şekilde sağlamak için baskı bırakmadan önce temiz bir jilet bıçağı ileri geri hareket etmek için emin olun dilimleme yarısında plasenta kesmek bile kesti. Plasenta, daha sonra plasental HKH'lerin görselleştirmek için en iyi prientation ulaşmak için yarıya.
3. Bir kalıbın alt yüzeyi ile temas halinde kesme kenarı ile kalıp altındaki plasenta yarım. Diğer yarısı için yeni bir kalıp ile tekrarlayın. E10.5 plasenta için, her iki devreyi de aynı tekniği kullanarak aynı kalıp içine konabilir.
4. , Kalıp içine OCT dökülerek zaman, doğru yönde plasenta tutmak zor olabilir. Doku forseps ile yarım tutarak yerde plasenta sabitleyin. Ekim çözüm kalıp içine yavaşça dökün ve varsa kabarcıkları kaçının. E10.5 plasenta, forseps bir doku yarısını tutun ve forseps dışında diğer doku karşı yarım bekletin. Ekim çözüm E12.5 plasenta açıklandığı gibi yavaşça dökün.
5. Kalıp OCT ile doldurulduktan sonra, hızlı bir şekilde kuru buz üzerine kalıp, OCT doku dondurma beyaz flaş dönecek
6. Kalıp Drierite içeren küçük bir plastik torba içine koyun ve hemen -80 ° C derin dondurucuda saklayın.

Discussion

Bu protokol açıklanan deneysel prosedürleri plasental doku ve hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin izolasyonu ve görüntüleme için izin verir. Fetal gelişim boyunca plasenta ve diğer fetal hematopoetik organlar HKH'lerin beklenen hücresel verim ve sayısı hakkında kapsamlı bir özeti için Gekas, ark bakın. 2005. Plasenta gelişmekte HKH'lerin ve diğer hematopoetik hücreler lokalizasyonu için Rodos ve ark bakın. 2008.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)