Summary
حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم خلال التنمية. وجدنا أن كلا إنشاء خلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتوسعت في المشيمة في محاريب microenvironmental فريدة من نوعها. هنا ، نحن تصف التقنيات التجريبية المطلوبة للعزلة وتصور HSCs في المشيمة الماوس.
Abstract
الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) لديها القدرة على تجديد الذات وتوليد كل أنواع الخلايا من الدم في جميع أنحاء الأنساب عمر الفرد. جميع HSCs تظهر خلال نمو الجنين ، وبعد ذلك يتم الاحتفاظ حجمها تجمع بواسطة الذاتي تجديد الانقسامات الخلوية. تحديد المنشأ التشريحي للHSCs والأحداث الحاسمة التنموية التي تنظم عملية التنمية HSC تعقدت كمواقع تشريحية كثيرة خلال المشاركة تكون الدم في الجنين. مؤخرا ، حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم حيث يتم إنشاء HSCs وتوسعت في محاريب microenvironmental فريد (جيكاس ، وآخرون 2005 ، ورودس ، وآخرون 2008). وبالتالي فإن المشيمة مصدر مهم من خلال ظهور HSCs وتوسعها الأولية.
في هذه المقالة ، نعرض أساليب تشريح للعزلة المشيمة من الفئران وE10.5 E12.5 الأجنة ، المقابلة لمراحل تطور بدء HSCs والذروة في حجم تجمع HSC في المشيمة ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم بروتوكول الأمثل لتفارق الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة المشيمة وحيدة الخلية في تعليق لاستخدامها في التدفق الخلوي أو المقايسات الفنية. لقد وجدنا أن استخدام كولاجيناز عن وحيدة الخلية تعليق المشيمة يعطي غلة كافية من HSCs. عامل مهم يؤثر HSC العائد من المشيمة هي درجة التفكك الميكانيكية قبل ، ومدتها ، ومعالجة القرنية.
ونحن نقدم أيضا على بروتوكول لإعداد الثابتة المجمدة أقسام النسيج المشيمي لوضع التصور HSCs بواسطة المناعية الخلوية في مطلبهم دقيقة. كما لا يتم الاحتفاظ مستضدات محددة للدم أثناء إعداد الأبواب جزءا لا يتجزأ من البارافين ، ونحن نستخدم بشكل روتيني المجمدة أقسام ثابتة لتوطين HSCs المشيمة والأسلاف.
Protocol
1. إزالة الجنين والمشيمة تشريح
- لتبدأ ، يجب أن تكون معزولة أول أجنة الحوامل من السدود.
- يصرح باستخدامها في الحيوانات وفقا للإجراءات المعتمدة -- في حالتنا نحن نذهب إلى استخدام جرعة قاتلة من مخدر isoflurane
- أولا ، مع رش بطن الإيثانول وإحداث شق صغير مع زوج من مقص.
- بعيدا المسيل للدموع على الجلد بكلتا يديه لكشف البطن وخفض فتح البريتوني.
- بالملقط ، والتقاط قرون الرحم وجمعها باستخدام مقص في نهاية كل القاصي. مكان القرون الرحم في طبق بتري مليئة PBS ومكان على الجليد. أيضا ، تذكر أن يغسل عدة مرات مع برنامج تلفزيوني قبل عزل المشيمة. يمكننا الآن عزل المشيمة.
- مع اثنين من الملقط ، تبدأ عملية التقشير بعناية بعيدا عن الأنسجة المحيطة conceptuses بطانة الرحم الجنين. وينبغي للمرء أن يكون حريصا على عدم إلحاق ثقب أو خلاف ذلك الضرر الهيكلي للأجنة ، لأن هذا سيؤدي إلى تعقيد خطوات تشريح لاحقة.
- ضع conceptuses معزولة في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني على الجليد وتستمر حتى يتم الافراج عن جميع conceptuses من بطانة الرحم.
- نقل أحد المستكن في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني وضعت تحت المجهر وملقط مع اثنين من قشر الساقط بعيدا عن المشيمة. إزالة أكبر قدر من الساقط ممكن الخلايا الساقط سوف تتداخل مع وحيدة الخلية التعليق والتدفق الخلوي. ينصح سلاسة الحركة تقشير المستمر لتحقيق أفضل النتائج.
- قطع الكيس المحي بعيدا من المشيمة عند تقاطع بين الجهازين وسحب الكيس بلطف صفار المحية والسفن بعيدا عن المشيمة. وينبغي الحرص على عدم تعطيل لوحة المشيمي من المشيمة ، وخصوصا مع أجنة مبكرة.
- عقد بعناية لوحة المشيمي من المشيمة مع زوج واحد من الملقط والحبل السري مع آخر ، وسحب الحبل السري والجنين تعلق بعيدا عن المشيمة.
- إزالة الزائدة نسيج الخلايا العملاقة على حواف المشيمة من أجل تقليل الخلية التثاقل خلال إعداد وحيدة الخلية تعليق.
- جمع المشيمة في وعاء مناسب ، مثل انبوب فالكون 15 مل ، مع ٪ PBS FCS +5 ، وعلى الجليد. نفعل ذلك لجميع مشيمة تشريح.
- عند هذه النقطة ، يمكنك إما المضي قدما في إعداد تعليق وحيدة الخلية عن التدفق الخلوي ، المقايسات وظيفية ، مثل الثقافة في المختبر أو زرع ، أو إعداد المشيمة بأكملها لتثبيت الأنسجة والمجمدة كتلة ثابتة لتضمين المناعية في نهاية المطاف.
2. إعداد وحيدة الخلية تعليق من نسيج المشيمة
- وسوف نعرض لك الآن كيفية إنشاء تعليق خلية واحدة من المشيمة للتحليل FACS.
- لإعداد تعليق خلية واحدة من المشيمة والميكانيكية والأنزيمية تفارق هو مطلوب. إعداد أول حل كولاجيناز 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ حل البنسلين / الستبرتوميسين.
- إضافة حجم مناسب لإيجاد حل للمشيمة كولاجيناز ، اعتمادا على كيفية العديد من لديك. ينصح حدة التخزين التي هي ضعف حجم المشيمة وبين 5ml - 2.
- استخدام إبر 16 - G تركيبها على حقنة 5 مل لتعطيل ميكانيكيا بواسطة نسيج الركض الحل كولاجيناز والمشيمة من خلال إبرة 3 مرات. كرر بإبرة 18 - G.
- مكان العينة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 45 دقيقة.
- بعد 45 دقيقة في الحضانة ، كولاجيناز مرور حل الخلية من خلال إبرة 20 - G ، واحتضان ل45 دقيقة إضافية ، في 37 درجة مئوية.
- بعد ساعة حضانة 1.5 في مجموع ، كولاجيناز مرور حل الخلية من خلال مجموعة ال 22 والإبر 25 - G 3 مرات مع كل إبرة.
- تصفية العينة من خلال تصفية 50 ميكرومتر موصولة إلى أنبوب جديد فالكون 15 مل ، ويغسل مع FCS PBS +5 ٪ وأجهزة الطرد المركزي في 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية في 300 × ز
- عند هذه النقطة ، لدينا تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل FACS أو المقايسات الفنية.
3. لتثبيت الأنسجة الأقسام مجمدة
- مباشرة بعد عزل كل من مشيمة الجنين ، يتم وضعها في برنامج تلفزيوني 1X الباردة. عادة ما يكون لوحة 96 - جيدا يعمل على نحو أفضل للمشيمة الشباب (E8.5 - 11.5) ، ولكن مع كبار السن والمشيمة ، E12.5 وكبار السن ، لوحة 24 كذلك قد تكون أكثر ملاءمة.
- يتم نقل كل جديد في المشيمة شغلها بشكل جيد مع إذابة paraformaldahyde طازجة أو 4 ٪ PFA. للمشيمة E12.5 ، يتم نقل الأنسجة لحفر بئر جديدة من جهة ، ولكن بالنسبة للE10.5 يمكنك إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة بعناية وإضافة PFA. من المهم أن يتم مغمورة تماما المشيمة لمدة 2-4 ساعات في 4 درجات مئوية ، اعتمادا على عمر وحجم الأنسجة.
- نقل الأنسجة في السكروز 30 ٪ ، أو إذا كان أنسجة صغيرة جدا وهشة ، ونضح PFA وإضافة السكروز مباشرة. في هذه المرحلة ، سوف تكون المشيمة العائمة في الحل. ترك المبيت في الأنسجة 4 درجات مئوية.
- بعد الخطوة بين عشية وضحاها في السكروز 30 ٪ ، يجب أن الأنسجة تغرق في نهاية المطاف إلى قاع البئر ، مما يدل على الحفظ بالتبريد المناسبة. إزالة نصف حل واستبدال السكروز مع حجم ومكان أكتوبر النسيج مرة أخرى في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 ساعات. هذا يسهل أكتوبر الاختراق.
- نقل الأنسجة إلى أكتوبر بنسبة 100 ٪ لمدة 1 ساعة ، وبعد ذلك يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من ذلك.
4. تضمين الأنسجة الثابتة
- قوالب من البلاستيك مع تحديد التسمية المناسبة الأنسجة (العفن تظهر مثلا).
- سحب الأنسجة حل للخروج من أكتوبر وقطع المشيمة في النصف بحلول توجيه المشيمة على شكل قرص مع الجانب السري الحبل لأسفل وتشريح بعناية بشفرة حلاقة نظيفة مع التأكد من نقل شفرة ذهابا وإيابا قبل إطلاق الضغط لضمان خفضا أكبر. يتم قطع المشيمة في نصف لتحقيق أفضل prientation لتصور في وقت لاحق HSCs المشيمة.
- half مكان المشيمة واحد في الجزء السفلي من العفن مع حافة قطع الاتصال مع السطح السفلي من العفن. مع تكرار قالب جديد للنصف الآخر. للمشيمة E10.5 ، قد وضعت كل شطر في القالب نفسه باستخدام نفس التقنية.
- عندما تتدفق أكتوبر في القالب ، فإنه يمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على المشيمة في الاتجاه الصحيح. تأمين مكان المشيمة في النصف خلال عقد النسيج بالملقط. صب ببطء أكتوبر حل في القالب وتجنب إنتاج أي فقاعات. للمشيمة E10.5 ، عقد نصف بواسطة ملقط النسيج والباقي في النصف الأنسجة الأخرى ضد خارج ملقط. صب ببطء أكتوبر الحل كما هو موضح لE12.5 مشيمة.
- مرة واحدة يتم تعبئة القالب مع أكتوبر ، ومكان العفن بسرعة على الثلج الجاف ، سوف تتحول أكتوبر ميض أبيض تجميد الأنسجة
- مكان القالب داخل حقيبة بلاستيكية صغيرة تحتوي على Drierite وتخزينها مباشرة في الثلاجة -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والإجراءات التجريبية وصفها في هذا البروتوكول يسمح للعزلة والتصور من نسيج المشيمة والخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف. للحصول على ملخص شامل عن العائد المتوقع الخليوي وعدد من HSCs في المشيمة وغيرها من الأجهزة المكونة للدم الجنين خلال مراحل تطوره الجنين نشير إلى جيكاس ، وآخرون. 2005. لتوطين HSCs النامية والخلايا المكونة للدم في المشيمة أخرى نشير إلى رودس ، وآخرون. 2008.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100mM Glucose | |||
| 10mM NaN3 | |||
| 15-ml conical tubes (BD) | |||
| 16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD) | |||
| 30% Sucrose Solution | |||
| 35mm Petri Dishes (BD) | |||
| 4% Paraformaldehyde | |||
| 50- m cell filters (Celltrics) | |||
| 5-ml syringes (BD) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector) | |||
| Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector) | |||
| Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution | |||
| Collagenase type I (Sigma) | |||
| Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) | |||
| Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation) | |||
| Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55 | |||
| Drierite | |||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher) | |||
| Glucose Oxidase 1000u/ml | |||
| Levamisole (Vector) | |||
| Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ) | |||
| Normal Horse Serum (Vector) | |||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) | |||
| Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+) | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+) | |||
| Plastic Slide Box (holds 100 slides) | |||
| Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable) | |||
| Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) | |||
| Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) | |||
| Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher) | |||
| Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon) | |||
| Tween20, SigmaUltra (Sigma) | |||
| Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) | |||
| Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector) | |||
| Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) |
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
