Biology

अलगाव और अपरा से hematopoietic स्टेम सेल का विश्लेषण

Published: June 24, 2008 doi: 10.3791/742

Christos Gekas¹, Katrin E. Rhodes¹, Hanna K. A. Mikkola¹

¹Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

Summary

हम विकास के दौरान एक प्रमुख hematopoietic अंग के रूप में नाल की पहचान की है. हमने पाया है कि hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) दोनों उत्पन्न कर रहे हैं और अद्वितीय microenvironmental niches में नाल में विस्तार. यहाँ, हम प्रयोगात्मक अलगाव और माउस नाल में HSCs के दृश्य के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन.

Abstract

Hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) आत्म नवीनीकृत और एक व्यक्ति की जीवन भर खून प्रजातियों के सभी प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता है. सभी HSCs भ्रूण विकास के दौरान उभरने, जो अपने पूल के आकार के बाद स्वयं renewing सेल डिवीजनों के द्वारा बनाए रखा है. HSCs और महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं HSC विकास की प्रक्रिया को विनियमित करने के संरचनात्मक मूल की पहचान के रूप में कई संरचनात्मक साइटों भ्रूण hematopoiesis के दौरान भाग लेने के जटिल है. हाल ही में, हम एक प्रमुख hematopoietic अंग जहां HSCs उत्पन्न होते हैं और अद्वितीय microenvironmental niches में विस्तार (Gekas, एट अल, 2005 रोड्स, एट अल 2008) के रूप में नाल की पहचान की. नतीजतन, अपरा उनके उद्भव और प्रारंभिक विस्तार के दौरान एक HSCs की एक महत्वपूर्ण स्रोत है.

इस अनुच्छेद में, हम E10.5 और E12.5 भ्रूण, HSCs की दीक्षा और नाल में HSC पूल के आकार में चोटी के विकास के चरणों के लिए इसी, क्रमशः से murine नाल के अलगाव के लिए विच्छेदन तकनीक दिखा. इसके अलावा, हम वर्तमान प्रवाह cytometry या कार्यात्मक assays में उपयोग के लिए एकल कक्ष निलंबन में placental ऊतक के enzymatic और यांत्रिक हदबंदी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल. हमने पाया है कि नाल के एकल कक्ष निलंबन के लिए collagenase के उपयोग HSCs की पर्याप्त पैदावार देता है. एक महत्वपूर्ण कारक नाल से HSC उपज को प्रभावित यांत्रिक हदबंदी से पहले की डिग्री है, और, enzymatic उपचार अवधि है.

हम भी अपने सटीक सेलुलर niches में immunohistochemistry से HSCs के विकास के दृश्य के लिए निर्धारित जमी अपरा ऊतक वर्गों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. के रूप में hematopoietic विशिष्ट प्रतिजनों आयल एम्बेडेड वर्गों की तैयारी के दौरान संरक्षित नहीं हैं, हम नियमित अपरा HSCs और progenitors स्थानीयकृत के लिए तय जमी वर्गों का उपयोग करें.

Protocol

1. भ्रूण हटाने और अपरा विच्छेदन

शुरू करने के लिए, भ्रूण पहली बार गर्भवती बांधों से अलग होना चाहिए.
पशु अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार euthanized हैं - हमारे मामले में हम संवेदनाहारी isoflurane का एक घातक खुराक का उपयोग करने के लिए जा रहे हैं
सबसे पहले, इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे और कैंची की एक जोड़ी के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं.
दोनों हाथों से दूर त्वचा फाड़ पेट को उजागर करने के लिए और खुले peritoneum में कटौती.
संदंश के साथ, गर्भाशय सींग लेने और उन्हें प्रत्येक बाहर का अंत में कैंची का उपयोग कर इकट्ठा. पीबीएस और बर्फ पर जगह के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग रखें. इसके अलावा, पीबीएस साथ नाल अलग से पहले कई बार धोने के लिए याद है. अब हम प्लेसेंटा को अलग कर सकते हैं.
दो संदंश के साथ, ध्यान से दूर छीलने एंडोमेट्रियल भ्रूण conceptuses आसपास के ऊतकों शुरू करते हैं. एक पंचर या अन्यथा भ्रूण को संरचनात्मक नुकसान दण्ड के रूप में इस बाद विच्छेदन कदम जटिल नहीं सावधान रहना चाहिए.
बर्फ पर एक पीबीएस के साथ नए पेट्री डिश में अलग conceptuses प्लेस और जारी रखें जब तक सभी conceptuses अंतर्गर्भाशयकला से मुक्त किया गया है.
पीबीएस के साथ एक नया पेट्री डिश खुर्दबीन के नीचे रखा और नाल से दूर decidua छील दो संदंश के साथ एक conceptus स्थानांतरण. के रूप में संभव के रूप में decidua की ज्यादा के रूप में decidua कोशिकाओं एकल कक्ष निलंबन और cytometry प्रवाह के साथ हस्तक्षेप करेगा निकालें. एक चिकनी निरंतर गति छीलने के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है.
जर्दी थैली दो अंगों के बीच जंक्शन पर अपरा से दूर और कट धीरे जर्दी थैली और vitelline वाहिकाओं नाल से दूर खींच. देखभाल जल्दी भ्रूण के साथ विशेष रूप से नाल की कोरियोनिक थाली बाधित नहीं लिया जाना चाहिए.
ध्यान संदंश की एक जोड़ी और दूसरे के साथ गर्भनाल के साथ नाल की कोरियोनिक थाली पकड़े, गर्भनाल और प्लेसेंटा से संलग्न भ्रूण दूर खींच.
नाल के किनारों पर अतिरिक्त विशाल सेल ऊतक निकालें क्रम में एकल कक्ष निलंबन की तैयारी के दौरान सेल clumping को कम से कम.
एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब जैसे एक उपयुक्त कंटेनर में पीबीएस 5% FCS के साथ नाल और बर्फ पर, ले लीजिए. सभी dissected placentas के लिए यह मत करो.
इस बिंदु पर, आप या तो प्रवाह cytometry, जैसे इन विट्रो संस्कृति या प्रत्यारोपण में कार्यात्मक assays, के लिए एक एकल कोशिका निलंबन की तैयारी के साथ आगे बढ़ना कर सकते हैं, या ऊतक निर्धारण और अंततः immunohistochemistry के लिए तय जमी एम्बेड ब्लॉक के लिए पूरी नाल तैयार.

2. एकल कोशिका अपरा ऊतक के निलंबन की तैयारी

अब हम आपको बताएंगे कि कैसे FACS विश्लेषण के लिए एक नाल से एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए होगा.
नाल से एक एकल कक्ष निलंबन, यांत्रिक और enzymatic पृथक्करण तैयार करने के लिए आवश्यक है. पहले पीबीएस में 10% FCS और 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ एक 0.1% Collagenase समाधान तैयार है.
Placentas कितने तुम पर निर्भर करता है collagenase समाधान के एक उचित मात्रा में जोड़ें. एक मात्रा है कि दो बार नाल और 2-5ml के बीच मात्रा की सिफारिश की है.
16 जी एक 5 मिलीलीटर यंत्रवत् सुई 3 बार के माध्यम से collagenase समाधान और अपरा passaging द्वारा ऊतक बाधित सिरिंज पर फिट सुई का प्रयोग करें. एक 18 जी सुई के साथ दोहराएँ.
37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए नमूना रखें.
Collagenase, यात्रा, 20 जी एक सुई के माध्यम से सेल समाधान है, और एक अतिरिक्त 45 मिनट के लिए 37 में, सेते डिग्री सेल्सियस में 45 मिनट ऊष्मायन के बाद
22 जी और 25 जी सुई के माध्यम से 1.5 घंटा collagenase, बीतने सेल समाधान में कुल ऊष्मायन के बाद प्रत्येक सुई के साथ 3 बार.
एक 50 सुक्ष्ममापी एक नया 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब से जुड़ी फिल्टर के माध्यम से नमूना फ़िल्टर, 4 में पीबीएस 5% FCS और अपकेंद्रित्र के साथ धो ° 300 पर 5 मिनट के लिए सी × जी
इस बिंदु पर, हम एक एकल कक्ष निलंबन FACS विश्लेषण या कार्यात्मक assays के लिए उपयुक्त है.

3. जमे हुए वर्गों के लिए ऊतक फिक्सेशन

प्रत्येक भ्रूण से नाल अलग करने के तुरंत बाद, वे ठंड 1X पीबीएस में रखा जाता है. आम तौर पर एक 96 अच्छी तरह से थाली युवा placentas (E8.5 - 11.5) के लिए सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन बड़े placentas E12.5 और पुराने, 24 अच्छी तरह से एक थाली और अधिक सुविधाजनक हो सकता है.
प्रत्येक नाल हौसले thawed 4% paraformaldahyde या पीएफए के साथ एक अच्छी तरह से भरा नई में स्थानांतरित किया है. E12.5 placentas के लिए, ऊतक हाथ से एक नए तरह के लिए ले जाया जाता है, लेकिन E10.5 के लिए आप पीबीएस ध्यान से एक विंदुक के साथ हटा सकते हैं और जोड़ पीएफए. यह महत्वपूर्ण है कि प्लेसेंटा पूरी तरह से 4 ° C पर 2-4 घंटे के लिए डूब ऊतक की उम्र और आकार पर निर्भर करता है,.
30% sucrose में ऊतक स्थानांतरण, या अगर ऊतकों के बहुत छोटे और नाजुक रहे हैं, पीएफए aspirate और sucrose सीधे जोड़ने. इस स्तर पर, placentas समाधान में तैर जाएगा. ऊतकों 4 में रात भर रहने चलो ° सी.
30% sucrose में रातोंरात कदम के बाद, ऊतकों अंततः अच्छी तरह से नीचे, उचित cryopreservation का संकेत करने के लिए सिंक चाहिए. Sucrose के समाधान के आधा निकालें और अक्टूबर के साथ मात्रा की जगह और ऊतक वापस 4 ° 1-2 घंटे के लिए सी में जगह. यह अक्टूबर प्रवेश की सुविधा.
1 घंटे के लिए 100% अक्टूबर ऊतक, स्थानांतरण जिसके बाद यह एम्बेड किया जा सकता है.

4. फिक्स्ड ऊतक एम्बेडिंग

लेबल उचित ऊतक पहचान (शो उदाहरण मोल्ड) के साथ प्लास्टिक molds.
ऊतक बाहर खींचो और अक्टूबर के समाधान के गर्भनाल नीचे का सामना करना पड़ पक्ष के साथ डिस्क के आकार नाल orienting और ध्यान सुनिश्चित करने के दबाव को जारी करने से पहले एक साफ धार ब्लेड आगे और पीछे ले जाने के लिए सुनिश्चित करने के साथ टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा आधे में नाल में कटौती एक और भी कटौती. नाल आधे में कटौती के लिए सबसे अच्छा prientation प्राप्त करने के बाद अपरा HSCs कल्पना.
प्लेस आचारण के नीचे मोल्ड के नीचे की सतह के साथ संपर्क में कटौती की बढ़त के साथ नाल आधा. अन्य आधे के लिए एक नए सांचे के साथ दोहराएँ. E10.5 placentas के लिए, दोनों आधा ही उसी तकनीक का उपयोग मोल्ड में रखा जा सकता है.
जब मोल्ड में डालने का कार्य अक्टूबर, यह कठिन हो सकता है उचित ओरिएंटेशन में placentas रखने कर सकते हैं. संदंश के साथ ऊतक आधा पकड़े द्वारा जगह में नाल सुरक्षित. धीरे धीरे मोल्ड में अक्टूबर समाधान डालना और किसी भी बुलबुले के उत्पादन से बचें. E10.5 placentas के लिए, संदंश द्वारा एक ऊतक आधा पकड़ और अन्य ऊतक संदंश के बाहर के खिलाफ आधा आराम. धीरे धीरे अक्टूबर के रूप में E12.5 placentas लिए वर्णित समाधान डालना.
एक बार मोल्ड अक्टूबर से भरा है, जल्दी सूखी बर्फ पर मोल्ड जगह, अक्टूबर सफेद ऊतक ठंड फ्लैश बंद हो जाएगा
एक छोटे से प्लास्टिक बैग में Drierite युक्त मोल्ड प्लेस और तुरंत ° सी फ्रीजर -80 में दुकान है.

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Discussion

प्रयोगात्मक इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं अलगाव और अपरा ऊतक और hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के दृश्य के लिए अनुमति देगा. उम्मीद सेलुलर उपज और भ्रूण के विकास के दौरान अपरा और अन्य भ्रूण hematopoietic अंगों में HSCs की संख्या पर एक व्यापक सारांश के लिए हम Gekas, एट अल देखें. 2005. विकासशील प्लेसेंटा में HSCs और अन्य hematopoietic कोशिकाओं के स्थानीयकरण के लिए हम रोड्स, एट अल के लिए देखें. 2008.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)

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References

Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).