Summary
Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.
Abstract
Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial.
Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático.
Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.
Protocol
1. Remoção do embrião e dissecção da placenta
- Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes.
- Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados - no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano
- Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura.
- Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio.
- Com uma pinça, pegue o cornos uterinos e recolhê-las usando uma tesoura em cada extremidade distal. Coloque o cornos uterinos em uma placa de petri preenchida com PBS e colocar no gelo. Além disso, lembre-se de lavar várias vezes com PBS antes de isolar a placenta. Agora podemos isolar a placenta.
- Com duas pinças, comece a descascar cuidadosamente o tecido endometrial em torno do embrião conceptos. Deve-se ter cuidado para não furar ou não causar danos estruturais aos embriões, pois isso irá complicar a dissecção passos subseqüentes.
- Coloque o conceptos isoladas numa placa de Petri novo com PBS sobre o gelo e continuar até que todos os conceptos foram libertados do endométrio.
- Transferência de um concepto para uma nova placa de Petri com PBS colocado sob o microscópio e com duas pinças de descascar a decidua longe da placenta. Remover o máximo do possível decídua como células decidua irá interferir com a suspensão de uma única célula e citometria de fluxo. Um movimento contínuo suave peeling é recomendado para alcançar os melhores resultados.
- Cortar o saco vitelino longe da placenta na junção entre os dois órgãos e puxe o saco vitelino e vasos vitelínico longe da placenta. Cuidados devem ser tomados para não perturbar a placa coriônica da placenta, especialmente com embriões.
- Cuidadosamente segurando a placa coriônica da placenta com um par de fórceps e do cordão umbilical com outro, puxa o cordão umbilical e embrião ligado longe da placenta.
- Remover o tecido celular excesso de gigante nas bordas da placenta, a fim de minimizar a aglutinação das células durante a preparação de uma única célula de suspensão.
- Recolher a placenta em um recipiente apropriado, como um tubo Falcon de 15 ml, com PBS 5% FCS e no gelo. Faça isso para todas as placentas dissecados.
- Neste ponto, você pode prosseguir com a preparação de uma suspensão de uma única célula de citometria de fluxo, ensaios funcionais, tais como a cultura in vitro ou transplante, ou preparar placenta inteira para fixação do tecido e bloco congelado fixo incorporação de imuno-histoquímica eventual.
2. Preparação de uma única célula de suspensão de tecido placenta
- Vamos agora mostrar como gerar uma suspensão única célula da placenta para análise FACS.
- Para preparar uma suspensão única célula da placenta, mecânica e dissociação enzimática é necessária. Primeiro preparar uma solução de colagenase 0,1% em PBS com 10% SFB e 1% de solução a penicilina / estreptomicina.
- Adicionar um volume adequado de solução de colagenase a placentas, dependendo de quantos você tem. Um volume que é o dobro do volume de placenta e entre 2-5ml é recomendado.
- Use uma agulha de 16 G montado em uma seringa de 5 ml para mecanicamente perturbar o tecido por passaging a solução de colagenase e da placenta através da agulha 3 vezes. Repita com uma agulha de 18-G.
- Colocar a amostra a 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 por 45 minutos.
- Após a incubação de 45 minutos em colagenase, a passagem da célula solução através de uma agulha de 20 G, e incubar por mais 45 minutos, em 37 ° C.
- Após a incubação 1,5 hr total em colagenase, a passagem da célula solução a 22-G e 25-G agulhas 3 vezes com cada agulha.
- Filtrar a amostra através de um filtro 50 mícrons anexado a um novo tubo Falcon de 15 ml, lavar com PBS FCS 5% e centrifugar a 4 ° C durante 5 minutos a 300 × g.
- Neste ponto, temos uma única célula de suspensão adequado para FACS análise ou ensaios funcionais.
3. Fixação de tecidos para as secções congeladas
- Imediatamente após o isolamento da placenta de cada embrião, eles são colocados no frio 1X PBS. Normalmente, uma placa de 96 poços funciona melhor para placentas jovens (E8.5-11.5), mas com placentas mais velhos, E12.5 e mais velhos, uma placa de 24 poços pode ser mais conveniente.
- Cada placenta é transferido para um novo poço cheio de recém descongelados paraformaldahyde 4% ou PFA. Para E12.5 placentas, o tecido é movido para um novo poço com a mão, mas para o E10.5 você pode remover o PBS cuidadosamente com uma pipeta e adicione o PFA. É importante que a placenta está totalmente imersa por 2-4 horas a 4 ° C, dependendo da idade e tamanho do tecido.
- Transferir o tecido em sacarose 30%, ou se os tecidos são muito pequenos e frágeis, aspirar o PFA e adicione a sacarose diretamente. Nesta fase, as placentas estará flutuando em solução. Deixe os tecidos pernoite a 4 ° C.
- Após a etapa durante a noite em sacarose 30%, os tecidos devem em última instância, desceria ao fundo do poço, indicativo de criopreservação apropriado. Retire metade da solução de sacarose e substituir o volume com outubro e coloque o tecido de volta em 4 ° C por 1-2 horas. Isso facilita a penetração de outubro
- Transfira o tecido para outubro 100% por 1 hora, após o que pode ser incorporado.
4. Incorporação do tecido fixado
- Moldes de plástico com etiqueta de identificação de tecido apropriado (exemplo molde show).
- Puxe o tecido para fora da solução outubro e cortar pela metade a placenta orientando a placenta em forma de disco com o lado do cordão umbilical para baixo e, cuidadosamente, cortando com uma lâmina limpa certificando-se de mover a lâmina frente e para trás antes de liberar a pressão para garantir um mesmo corte. A placenta é cortado ao meio para alcançar os melhores prientation mais tarde visualizar os HSCs placentária.
- Coloque metade placenta outra na parte inferior do molde com a borda de corte em contato com a superfície inferior do molde. Repita o procedimento com um novo molde para a outra metade. Para E10.5 placentas, ambas as metades podem ser colocados no mesmo molde usando a mesma técnica.
- Quando vazar outubro no molde, pode ser difícil manter o placentas na orientação correta. Assegurar a placenta no lugar, segurando a metade do tecido com uma pinça. Lentamente, deitar solução outubro no molde e evitar a produção de todas as bolhas. Para E10.5 placentas, segure uma metade do tecido por uma pinça e descansar a metade outro tecido contra a parte externa do fórceps. Lentamente, deitar outubro solução como descrito para E12.5 placentas.
- Uma vez que o molde é preenchido com outubro, rapidamente colocar o molde em gelo seco, a OCT vai virar flash branco congelamento do tecido
- Coloque o molde em um pequeno saco de plástico contendo Drierite e imediatamente armazenar no freezer -80 ° C.
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Discussion
Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100mM Glucose | |||
10mM NaN3 | |||
15-ml conical tubes (BD) | |||
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD) | |||
30% Sucrose Solution | |||
35mm Petri Dishes (BD) | |||
4% Paraformaldehyde | |||
50- m cell filters (Celltrics) | |||
5-ml syringes (BD) | |||
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector) | |||
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector) | |||
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution | |||
Collagenase type I (Sigma) | |||
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) | |||
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation) | |||
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55 | |||
Drierite | |||
Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher) | |||
Glucose Oxidase 1000u/ml | |||
Levamisole (Vector) | |||
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ) | |||
Normal Horse Serum (Vector) | |||
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek) | |||
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector) | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+) | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+) | |||
Plastic Slide Box (holds 100 slides) | |||
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable) | |||
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) | |||
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) | |||
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher) | |||
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon) | |||
Tween20, SigmaUltra (Sigma) | |||
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) | |||
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector) | |||
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector) |
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).