Summary
I neutrofili sono tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria, e le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiata in vitro. Si dimostra uno standard gradiente di densità metodo di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibili in commercio.
Abstract
Granulociti neutrofili polimorfonucleati (PMN) sono i leucociti più abbondanti negli esseri umani e tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria. A causa del loro ruolo chiave nel processo infiammatorio, le funzioni dei neutrofili come locomozione, la produzione di citochine, fagocitosi, e combattere cellule tumorali sono ampiamente studiati. Per caratterizzare le funzioni specifiche di neutrofili, un metodo pulito, veloce e affidabile che li separa dai globuli altro è auspicabile che studi in vitro, specialmente da quando i neutrofili sono di breve durata e deve essere utilizzato entro 2-4 ore dalla raccolta. Qui, dimostrare un metodo standard di gradiente di densità di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibile in commercio che è una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. La procedura consiste di sangue intero stratificazione nel medio gradiente di densità, centrifugazione, separazione dello strato dei neutrofili, e lisi degli eritrociti residui. Le cellule vengono poi lavate, contate e risospese in tampone alla concentrazione desiderata. Quando eseguito correttamente, questo metodo ha dimostrato di produrre campioni di> neutrofili 95% con vitalità> 95%.
Protocol
Neutrofili isolamento Protocollo
- Portare i reagenti a temperatura ambiente.
- Raccogliere 5,0 ml di terreni di isolamento dei neutrofili in provetta da centrifuga. Con attenzione strato 5,0 ml di sangue sui mezzi di separazione. Effettuare questo passaggio, lentamente e con attenzione, e con la punta della pipetta vicino alla superficie del supporto per evitare di mescolare il sangue e dei media.
- Centrifugare a 500 RCF per 35 minuti a 20-25 ° C. Il sangue deve separare in 6 fasce distinte: al plasma, monociti, terreni di isolamento, i neutrofili, terreni di isolamento di più, e il rosso del sangue pellet cellulare (Figura 1). Se queste bande non sono chiare, il processo di separazione non era pulito e dovrà essere ripetuto.
- Rimuovere con attenzione i primi tre strati (plasma, monociti, e terreni di isolamento) usando una pipetta. Smaltire questi strati.
- Con attenzione pipetta lo strato di neutrofili e di tutti i terreni di isolamento sotto il neutrofili. Mettere la soluzione in una provetta da centrifuga pulita.
- Diluire la soluzione dei neutrofili a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +. Invertire il tubo di un paio di volte a sospendere le cellule.
- Centrifugare la soluzione dei neutrofili a 350 RCF per 10 minuti. Una pallina rossa deve essere presente sul fondo della provetta, contenente residui di neutrofili e globuli rossi (RBC). Eliminare il surnatante con una pipetta attenzione in modo che il pellet non è disturbato.
- Per lisare i globuli rossi residuo, aggiungere 2 ml di Lysis Buffer Red Cell per il tubo. Per risospendere il, pellet vortice del flacone in un ambiente di 3-4. Evitare di aumentare l'impostazione vortice superiore a 4, dal momento che questo può causare i neutrofili da attivare. Potrebbe essere necessario vortex per alcuni secondi, o di "impulso" il vortice di sciogliere il pellet.
- Centrifugare la provetta a 250 RCF per 5 min. Togliere il surnatante con la pipetta. Ripetere il processo di lisi, se necessario.
- Aggiungere 500 microlitri HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 + ad ogni provetta. Ancora una volta, vortice per risospendere il pellet in un ambiente di 3-4. Diluire a 10 ml con HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 +.
- Centrifugare le provette a 250 RCF per 5 min. Aspirare il surnatante e gettarlo.
- Risospendere il pellet in 250 microlitri HBSS / Soluzione HSA (2% HSA). Le cellule possono essere contati e regolato concentrazione desiderata.
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Discussion
Il gradiente di densità metodo di separazione viene utilizzato per isolare neutrofili umani da sangue intero con una miscela di sodio metrizoate e Destrano 500. Questo metodo si basa sul metodo di separazione dei leucociti mononucleari da Boyum (1968), che è stato modificato per la separazione dei neutrofili da Ferrante e Thong (1980).
Dopo la raccolta di un donatore, il sangue intero può essere anticoagulato con EDTA, citrato o eparina. Dal momento che sono di breve durata, i neutrofili devono essere utilizzati entro 2-4 ore dalla raccolta. La procedura consiste di sangue intero stratificazione nel medio gradiente di densità, centrifugazione, separazione dello strato dei neutrofili, e lisi degli eritrociti residui. Le cellule vengono poi lavate, contate e risospese alla concentrazione desiderata.
Se sei bande non sono distinte dopo la prima fase di centrifugazione, il processo di separazione non è stata pulita e dovrà essere ripetuto. Per la netta separazione, assicurarsi che i terreni di isolamento non è scaduto o contaminato. La separazione può anche fallire se il donatore di sangue ha consumato alcol o farmaci nelle 72 ore precedenti il prelievo del sangue.
Per evitare l'attivazione dei neutrofili durante la procedura di separazione, è meglio usare HBSS senza Ca2 + / Mg2 +, dal momento che gli ioni hanno dimostrato di cellule primo. Risospensione del pellet deve essere eseguita lentamente, e le impostazioni del vortice dovrebbe essere tenuto in basso a medio raggio in modo che le cellule non si attivano.
Quando eseguito correttamente, questo metodo ha dimostrato di produrre campioni di> neutrofili 95% con vitalità> 95%. La purezza e la vitalità può essere valutata mediante l'etichettatura le cellule con neutrofili specifico marcatore CD66b e trypan esclusione del colorante blu.
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Acknowledgments
Finanziamenti dal NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
