Summary
嗜中性粒细胞之间的第一个细胞到达炎症免疫反应的工地上，和其职能和机制，已被广泛地在体外研究。我们展示一个标准密度梯度分离法，隔离人类使用市售的分离介质从整个血液中性粒细胞。
Abstract
中性粒细胞的多形核粒细胞（PMN）在人类之间的第一个细胞到达炎症免疫反应的部位，最丰富的白细胞。由于其关键作用，在炎症，如中性粒细胞功能的运动，细胞因子的产生，的吞噬功能，和肿瘤细胞的作战广泛的研究。为特征的中性粒细胞的特定功能，其他血细胞分离干净，快速，可靠的方法是可取的，尤其是因为在体外研究中性粒细胞是短命的，应在2-4小时收集。在这里，我们展示了一个标准的密度梯度分离法，从全血使用市售分离介质，是一种混合物，钠metrizoate和右旋糖酐500人中性粒细胞隔离。由分层全血通过离心，密度梯度介质，中性粒细胞层的分离，剩余红细胞裂解的过程。细胞，然后洗净，计数，并在缓冲区所需浓度的悬浮。正确执行时，此方法已被证明收益率> 95％嗜中性粒细胞> 95％的可行性的样品。
Protocol
嗜中性粒细胞的分离协议
- 将所有试剂置于室温。
- 收集的5.0毫升离心管中的中性粒细胞隔离媒体。仔细层5.0毫升的血液分离介质，。执行这一步，缓慢而仔细地，并与介质的表面，以避免混合血液和媒体的枪头。
- 500 35分钟的离心力离心20-25℃。血液分离出6个不同组别：血浆，单核细胞，隔离媒体，中性粒细胞，更加孤立的媒体，以及红血细胞沉淀（图1）。如果不明确，这些频段的分离过程是不干净，将需要重复。
- 小心地取出前三名层（血浆，单核细胞，并进行隔离媒体），用吸管。这些层的处理。
- 仔细吸管嗜中性粒细胞和中性粒细胞下方的隔离媒体所有的层。放置到一个干净的离心管的解决方案。
- 没有的Ca 2 + / Mg 2 +的HBSS中稀释的中性粒细胞10毫升的解决方案。反转管几次暂停细胞。
- 离心机的中性粒细胞在10分钟的350离心力的解决方案。一个红色的沉淀应在试管底部，包含中性粒细胞和残留的红血细胞（红细胞）。用移液器取出上清液小心，颗粒不被打扰。
- 裂解残留的红细胞，加入2 ml红细胞裂解液管。悬浮颗粒，旋涡在小瓶设置3-4。避免增加上述4旋涡设置，因为这可能会导致中性粒细胞激活。它可能是必要的，以涡几秒钟，或以“脉冲”涡旋溶解沉淀。
- 250 5分钟的离心力离心管。取出上清液用吸管。重复裂解过程中，如果需要的话。
- 没有的Ca 2 + / 镁加500μL的HBSS +每管。同样，旋涡沉淀重悬在设置3-4。没有的Ca 2 + / Mg 2 +的HBSS中，稀释至10 ml 。
- 250 5分钟的离心力离心管。吸出上清液并丢弃。
- 250μL的HBSS / HSA的解决方案（2％，HSA）重悬沉淀。然后可以计算细胞，并调整到所需浓度。
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Discussion
密度梯度分离法是用来隔离从全血混合使用metrizoate钠和右旋糖酐500人中性粒细胞。这种方法是基于对Boyum（1968年）的单核白细胞分离法修改费兰特和通（1980）中性粒细胞分离。
从捐赠者收集后，全血用EDTA，柠檬酸或肝素抗凝。由于它们是短命的，中性粒细胞应收集2-4小时内使用。由分层全血通过离心，密度梯度介质，中性粒细胞层的分离，剩余红细胞裂解的过程。细胞，然后洗净，计算，并重新悬浮到所需浓度。
如果六阶后的第一个离心步骤不同，分离过程是不干净，将需要重复。清洁分离，确保隔离媒体尚未过期或已被污染。离职，也可能不成功，如果献血者在采血前72小时消耗的酒精或药物。
为了防止在分离过程中的中性粒细胞激活，最好使用无钙的HBSS + / Mg2 +的，因为离子总理细胞已被证明。再悬浮的颗粒也应缓慢进行，并应保持在低中档使细胞不被激活的涡设置。
正确执行时，此方法已被证明收益率> 95％嗜中性粒细胞> 95％的可行性的样品。标签与中性粒细胞特异性标志物CD66b和台盼蓝染料排斥细胞纯度和可行性进行评估。
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Acknowledgments
资金从美国国立卫生研究院R01 HL56621。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
