Summary
Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.
Abstract
Neutrofiele granulocyten polymorfonucleaire (PMN) zijn de meest voorkomende leukocyten bij mensen en bij de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons. Vanwege hun belangrijke rol in ontstekingen, zijn neutrofielen functies zoals motoriek, cytokine productie, fagocytose, en de tumorcel te bestrijden uitgebreid bestudeerd. Te bepalen wat de specifieke functies van neutrofielen, een schone, snelle en betrouwbare methode om ze te scheiden van andere bloedcellen is wenselijk voor in-vitro-studies, vooral omdat neutrofielen zijn van korte duur en moet worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. Hier tonen we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media dat is een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. De procedure bestaat uit lagen volbloed op de dichtheidsgradiënt medium, centrifugeren, scheiding van neutrofielen laag, en lysis van erytrocyten rest. Cellen worden vervolgens gewassen, geteld, en opnieuw gesuspendeerd in buffer tot de gewenste concentratie. Bij het correct wordt uitgevoerd, is deze methode is aangetoond dat monsters van> 95% neutrofielen met> 95% levensvatbaarheid opbrengst.
Protocol
Neutrofielen Isolatie Protocol
- Breng alle reagentia op kamertemperatuur.
- Verzamel 5,0 ml van neutrofielen isolatie media in centrifugebuis. Voorzichtig laagje 5,0 ml bloed over de scheiding media. Voer deze stap langzaam en voorzichtig, en met de pipet tip dicht bij de oppervlakte van de media om te voorkomen dat het mengen van het bloed en de media.
- Centrifugeer op 500 RCF gedurende 35 min bij 20-25 ° C. Het bloed op moet scheiden in 6 verschillende bands: plasma, monocyten, isolatie media, neutrofielen, meer isolatie media, en de rode bloedcellen pellet (figuur 1). Als deze banden niet duidelijk zijn, was het scheidingsproces niet schoon en zal moeten worden herhaald.
- Verwijder voorzichtig de bovenste drie lagen (plasma, monocyten en isolatie media) met een pipet. Bied deze lagen.
- Voorzichtig pipet de laag van neutrofielen en alle media de isolatie onder de neutrofielen. Plaats de oplossing in een schone centrifugebuis.
- Verdun de neutrofiel oplossing tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +. Omkeren van de buis een paar keer om de cellen te schorten.
- Centrifugeer de neutrofiele oplossing bij 350 RCF gedurende 10 minuten. Een rode pellet moet aanwezig zijn bij de bodem van de buis, met neutrofielen en resterende rode bloedcellen (RBC). Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet voorzichtig, zodat de pellet niet wordt verstoord.
- Om lyse de resterende rode bloedcellen, voeg 2 ml Red Cell Lysis Buffer naar de buis. Om resuspendeer de pellet, vortex de flacon in een instelling van 3-4. Voorkomen dat de vortex instelling boven de 4, omdat dit kan leiden tot de neutrofielen te activeren. Het kan nodig zijn om vortex te zijn voor enkele seconden, of naar "Pulse" van de vortex naar de pellet te ontbinden.
- Centrifugeer de buis bij 250 RCF gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een pipet. Herhaal het lyserende proces indien nodig.
- Voeg 500 ul HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 + aan elke buis. Nogmaals, vortex naar de pellet opnieuw in suspensie in een instelling van 3-4. Verdunnen tot 10 ml met HBSS zonder Ca 2 + / Mg 2 +.
- Centrifugeer de buizen op 250 RCF gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant af en gooi.
- Resuspendeer de pellet in 250 ul HBSS / HSA Oplossing (2% HSA). Cellen kunnen dan worden geteld en aangepast aan de gewenste concentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dichtheid gradiënt scheiding methode wordt gebruikt om de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met een mengsel van natrium-metrizoate en Dextran 500. Deze methode is gebaseerd op de mononucleaire leukocyten scheiding methode Boyum (1968), die was voor neutrofielen scheiding gewijzigd door Ferrante en Thong (1980).
Na het verzamelen van een donor, kan volledig bloed worden antistolling met EDTA, citraat of heparine. Omdat ze van korte duur, moet neutrofielen worden gebruikt binnen 2-4 uur van de collectie. De procedure bestaat uit lagen volbloed op de dichtheidsgradiënt medium, centrifugeren, scheiding van neutrofielen laag, en lysis van erytrocyten rest. Cellen worden vervolgens gewassen, geteld, en opnieuw gesuspendeerd in de gewenste concentratie.
Als de zes bands zijn niet duidelijk na de eerste stap centrifugeren, werd het scheidingsproces niet schoon en zal moeten worden herhaald. Voor schone scheiding, ervoor te zorgen dat het isolement media niet is verstreken of verontreinigd is. Scheiding kan ook mislukken als het bloed donor is van alcohol of medicatie in de 72 uur voorafgaand aan de bloedafname.
Om te voorkomen dat neutrofiel activatie tijdens de scheiding procedure, is het het beste om HBSS te gebruiken zonder Ca2 + / Mg2 +, omdat de ionen is gebleken dat eerste cellen. Resuspensie van pellets moet ook langzaam worden uitgevoerd, en vortex instellingen moeten worden bewaard in de low-tot mid-range, zodat cellen niet worden geactiveerd.
Bij het correct wordt uitgevoerd, is deze methode is aangetoond dat monsters van> 95% neutrofielen met> 95% levensvatbaarheid opbrengst. Zuiverheid en levensvatbaarheid kan worden getoetst door middel van etikettering van de cellen met neutrofiel-specifieke marker CD66b en trypan blauwe kleurstof uitsluiting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De financiering van NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
