Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

doi: 10.3791/745 Published: July 23, 2008

Summary

נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.

Abstract

גרנולוציטים polymorphonuclear נויטרופילים (PMN) הם leukocytes הנפוץ ביותר בבני אדם בין התאים הראשונים להגיע באתר של תגובה חיסונית דלקתית. בשל תפקיד המפתח שלהם דלקת, נויטרופילים פונקציות כגון תנועה, ייצור ציטוקינים, phagocytosis, ולחימה תאים סרטניים נלמדים בהרחבה. כדי לאפיין את פונקציות ספציפיות של נויטרופילים, שיטה נקי, מהיר, אמין הפרדתם כדוריות דם אחרים רצוי במבחנה, במיוחד מאז נויטרופילים הם קצרי חיים ויש להשתמש בהם תוך 2-4 שעות של האוסף. כאן, אנו מדגימים צפיפות תקן שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית כי הוא תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended במאגר לריכוז הרצוי. כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

  1. תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
  2. איסוף 5.0 מ"ל של התקשורת נויטרופילים בידוד צינור צנטריפוגות. בזהירות שכבה 5.0 מ"ל של דם על התקשורת ההפרדה. בצע שלב זה לאט ובזהירות, ועם קצה פיפטה קרוב לפני השטח של התקשורת, כדי למנוע ערבוב הדם בכלי התקשורת.
  3. צנטריפוגה ב RCF 500 דקות 35 ב 20-25 ° C. הדם צריך להפריד החוצה 6 להקות שונות: פלזמה, מונוציטים, מדיה בידוד, נויטרופילים, מדיה בידוד יותר, תא דם אדום גלולה (איור 1). אם להקות אלה אינם ברורים, את תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור.
  4. מוציאים בזהירות את החלק העליון שלוש שכבות (פלסמה, מונוציטים, התקשורת בידוד) באמצעות פיפטה. השלך את השכבות הללו.
  5. פיפטה בזהירות את השכבה של נויטרופילים וכל מדיה הבידוד מתחת נויטרופילים. מניחים את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
  6. לדלל את הפתרון נויטרופילים עד 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. הפוך את הצינור כמה פעמים להשעות את התאים.
  7. צנטריפוגה הפתרון נויטרופילים ב RCF 350 במשך 10 דקות. גלולה אדומה צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של הצינור, המכילה נויטרופילים שיורית בתאי הדם האדומים (RBCs). הסר את supernatant עם טפטפת בקפידה כך גלולה אינה מופרעת.
  8. כדי lyse RBCs שיורית, להוסיף 2 מ"ל הצפת האדום תמוגה תא אל הצינור. כדי resuspend, גלולה מערבולת את הבקבוקון על ההגדרה של 3-4. הימנע להגדיל את ההגדרה מערבולת מעל 4, שכן זה עלול לגרום נויטרופילים כדי להפעיל. זה עשוי להיות נחוץ כדי מערבולת למשך מספר שניות, או "דופק" מערבולת לפזר את גלולה.
  9. צנטריפוגה התחתית RCF 250 דקות 5. הסר את supernatant עם פיפטה. חזור על התהליך lysing אם נדרש.
  10. הוסף 500 μl HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg כדי צינור אחד. שוב, אל מערבולת resuspend גלולה בהגדרה של 3-4. מדולל ל 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. צנטריפוגה הצינורות בבית RCF 250 דקות 5. לשאוב supernatant וזורקים.
  12. Resuspend גלולה ב 250 HBSS μl / פתרון HSA (2% HSA). תאים עשויים אז ייספרו והותאמו הריכוז הרצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיפוע צפיפות שיטת ההפרדה משמש כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. שיטה זו מבוססת על שיטת ההפרדה mononuclear ליקוציט ידי Boyum (1968) אשר שונה להפרדה נויטרופילים ידי פראנטה Thong (1980).

לאחר איסוף מתורם דם, כולו עשוי להיות anticoagulated עם EDTA, ציטרט או הפרין. מאז הם קצרי חיים, נויטרופילים יש להשתמש תוך 2-4 שעות של האוסף. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended לריכוז הרצוי.

אם שש להקות אינם ברורים לאחר צנטריפוגה בשלב הראשון, תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור. עבור הפרדה נקייה, לוודא כי התקשורת בידוד לא פג או מזוהמים. ההפרדה יכול להיות גם מוצלח אם התורם דם יש לצרוך אלכוהול או תרופות ב 72 שעות לפני איסוף הדם.

כדי למנוע הפעלת נויטרופילים במהלך הליך ההפרדה, עדיף להשתמש HBSS ללא Ca2 + / Mg2 +, מאז יוני הוכחו תאים הממשלה. Resuspension של כדורי צריך גם להתבצע באיטיות, הגדרות מערבולת יש לשמור נמוכה בטווח אמצע כך לא התאים להיות מופעל.

כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%. טוהר ואת הכדאיות ניתן להעריך על ידי תיוג התאים עם נויטרופילים ספציפיים סמן CD66b ו trypan הדרה צבע כחול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מימון NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
נויטרופילים בידוד פרוטוקול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).More

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter