Summary
Neutrophils은 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 사이에하며, 그들의 기능과 메커니즘은 체외에서 광범위하게 연구되고있다. 우리는 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다.
Abstract
호중구 granulocytes polymorphonuclear (PMN)는 인간과 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 중 가장 풍부한 leukocytes 있습니다. 염증에서 중요한 역할로 인해, 이러한 운동, 시토킨 생산, phagocytosis, 그리고 종양 세포 전투로 호중구 기능이 광범위하게 연구하고 있습니다. neutrophils 짧은 - 살았하고 수집 2-4시간 이내에 사용해야합니다 특히 이후 neutrophils의 특정 기능을 특성화, 다른 혈액 세포에서 그들을 분리 깨끗하고, 빠르고, 안정 방법은, 체외 연구에서 위해 바람직합니다. 여기서 우리는 나트륨 metrizoate 및 Dextran 500의 혼합물이다 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 버퍼에 resuspended 있습니다. 제대로 수행되면,이 방법은> 95 % 생존과> 95 % neutrophils의 샘플을 항복을 보여줘왔다.
Protocol
호중구 격리 프로토콜
- 상온 모든 시약을 가져와.
- 원심 분리기 튜브의 호중구 격리 미디어 5.0 ML를 수집합니다. 분리 미디어를 통해 혈액 조심스럽게 층 5.0 ML. 천천히 그리고 신중하게, 그리고 혈액과 미디어를 혼합 피하기 위해 미디어의 표면에 가까운 피펫 팁이 단계를 수행합니다.
- 20-25에서 35 분 500 RCF에서 원심 분리기 ° C. 플라즈마, monocytes, 절연 매체, neutrophils, 더 절연 매체, 그리고 적혈구 세포 펠릿 (그림 1) 피는 6 별개의 밴드 밖으로 분리한다. 이 밴드가 명확하지 않은 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다.
- 조심스럽게 피펫을 사용하여 세 가지 레이어 (플라즈마, monocytes, 그리고 절연 매체)를 제거하십시오. 이러한 레이어의 배출.
- 조심스럽게 neutrophils과 neutrophils 아래 격리 미디어의 모든 레이어를 피펫. 깨끗한 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓으십시오.
- 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML에 호중구 솔루션을 희석. 세포를 일시 중 지할 수있는 튜브를 몇 번 반전.
- 10 분 350 RCF에서 호중구 솔루션을 원심 분리기. 빨간 펠렛은 neutrophils 및 잔여 적혈구 (RBCs)를 포함, 튜브의 하단에 제시해야합니다. 신중하게 그래서 펠렛가 방해되지 않았음을 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
- 잔류 RBCs를 lyse하려면, 튜브 2 ML 레드 세포 용해 완충액을 추가합니다. 펠렛, 소용돌이 3-4의 설정에 병을 resuspend한다. 이것은 neutrophils가 활성화가 발생할 수 있으므로, 4 위의 소용돌이 설정을 증가하지 마십시오. 그것은 몇 초 동안 와동해야 할 수도 있습니다, 또는 펠렛을 분해하는 소용돌이를 "펄스"로.
- 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 필요한 경우 lysing 과정을 반복합니다.
- 칼슘 2 + / MG이없이 500 μl HBSS를 추가 + 각 튜브 수 있습니다. 다시 3-4의 설정에서 펠렛을 resuspend하는 소용돌이. 칼슘 2 + / MG 2 + 않고 HBSS 10 ML로 희석.
- 5 분 250 RCF에서 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 폐기.
- 250 μl HBSS / HSA 솔루션 (2 % HSA)의 펠렛을 Resuspend. 전지는 다음 계산하고 원하는 농도로 조정할 수 있습니다.
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Discussion
밀도 기울기 분리 방법은 나트륨 metrizoate와 Dextran 500의 혼합물을 사용하여 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하는 데 사용됩니다. 이 방법은 Ferrante과 통 (1980)에 의해 호중구 분리으로 바뀌었습니다 Boyum (1968)에 의해 mononuclear 백혈구 분리 방식에 따라 달라집니다.
기증자로부터 수집 후, 전체 혈액은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 구연 산염, 또는 헤파린과 anticoagulated 수 있습니다. 그들은 짧은 - 살았되므로, neutrophils는 컬렉션의 2~4시간 이내에 사용해야합니다. 절차는 밀도 기울기 매체, 원심 분리, 호중구 계층의 분리, 그리고 잔류 적혈구의 용해를 통해 겹겹이 전체 혈액으로 구성되어 있습니다. 전지는 다음 씻어 계산하고, 원하는 농도 resuspended 있습니다.
여섯 밴드가 처음 원심 분리 단계 후에 별개하지 않는 경우, 분리 과정이 깨끗하지 못한 반복해야합니다. 깨끗한 분리, 절연 미디어가 만료되었거나 오염되지 않았는지 확인합니다. 혈액 기증자 혈액 수집하기 전에 72 시간 이내에 알코올이나 약물을 섭취있다면 분리도 실패할 수 있습니다.
분리 절차를 수행하는 동안 호중구 활성화를 방지하기 위해, 그것이 Ca2없이 HBSS를 사용하는 것이 가장 좋습니다 + / Mg2 + 이온이 주요 세포로 표시되었습니다 때문이다. 알약의 Resuspension도 천천히 수행되어야하고, 소용돌이 설정은 낮은 중순 범위 있도록 세포가 될 수없는거야 활성화에 보관해야합니다.
제대로 수행되면,이 방법은> 95 % 생존과> 95 % neutrophils의 샘플을 항복을 보여줘왔다. 순도 및 생존 능력은 호중구 특정 마커 CD66b와 trypan 블루 염색 제외있는 세포를 라벨에 의해 평가하실 수 있습니다.
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Acknowledgments
NIH R01 HL56621에서 자금.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
