Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Нейтрофилов Изоляция протокола

doi: 10.3791/745 Published: July 23, 2008

Summary

Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.

Abstract

Нейтрофилов полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) являются наиболее распространенными лейкоцитов в организме человека и одним из первых клетках, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа. Из-за их ключевую роль в воспалении, нейтрофилов функции, такие как передвижение, продукции цитокинов, фагоцитоз, и опухоль боевой ячейки хорошо изучена. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, чистый, быстрый и надежный метод, отделяющий их от других клеток крови желательно в лабораторных исследованиях, тем более, что нейтрофилы являются короткоживущими и должны быть использованы в течение 2-4 часов после сбора. Здесь мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных разделение средств массовой информации, что представляет собой смесь натрия и metrizoate Декстран 500. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали в буфере для желаемой концентрации. При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Нейтрофилов Изоляция протокола

  1. Довести все реагенты до комнатной температуры.
  2. Сбор 5,0 мл нейтрофилов изоляции СМИ в центрифуге трубки. Тщательно слой 5,0 мл крови за разделение средств массовой информации. Данный шаг следует выполнять медленно и осторожно, и с кончика пипетки близко к поверхности, средств массовой информации, чтобы избежать смешивания крови и средств массовой информации.
  3. Центрифуга при 500 RCF в течение 35 минут при температуре 20-25 ° C. Кровь должна выделить на 6 отдельных полос: плазма, моноцитов, изоляция СМИ, нейтрофилы, больше СМИ изоляции и красных клеток крови гранул (рис. 1). Если эти группы не ясны, процесс разделения не было чистым и необходимо будет повторить.
  4. Аккуратно снимите верхнюю три слоя (плазма, моноциты, и изоляции средств массовой информации) с помощью пипетки. Утилизация этих слоев.
  5. Тщательно пипеткой слой нейтрофилов и все средства массовой информации изоляции под нейтрофилов. Место раствор в чистую пробирку центрифуги.
  6. Развести нейтрофилов решение до 10 мл HBSS без Са 2 + / Mg 2 +. Обратить трубку несколько раз, чтобы приостановить клеток.
  7. Центрифуга нейтрофилов решение при 350 RCF течение 10 минут. Красный шарик должен присутствовать на дне пробирки, содержащие нейтрофилов и остаточной красных кровяных телец (эритроцитов). Удалить супернатант с пипеткой осторожно, чтобы шарик не нарушается.
  8. Для лизиса остаточных эритроцитов, добавляют 2 мл красного буфера лизиса клеток к трубе. Для ресуспендирования гранул, вихревые флаконе установка 3-4. Избегайте увеличения вихревой настройки выше 4, так как это может привести к активации нейтрофилов. Это может быть необходимо, чтобы вихрь в течение нескольких секунд, или "пульс" вихрь, чтобы растворить гранулы.
  9. Центрифуга трубке при 250 RCF в течение 5 мин. Удалить супернатант с пипеткой. Повторите лизировать процесс, если требуется.
  10. Добавить 500 мкл HBSS без Са 2 + / Mg 2 + в каждую пробирку. Опять же, вихрь для ресуспендирования гранул в установке 3-4. Развести в 10 мл HBSS без Са 2 + / Mg 2 +.
  11. Центрифуга труб при 250 RCF в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и выбросьте.
  12. Ресуспендируют осадок в 250 мкл HBSS / HSA Решение (2% HSA). Ячейки могут быть посчитаны и доводят до нужной концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Разделение градиента плотности метод используется для изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием смеси натрия metrizoate и Декстран 500. Этот метод основан на мононуклеарных лейкоцитов метод разделения Boyum (1968), который был модифицирован для нейтрофилов разделения Ферранте и стринги (1980).

После сбора от донора, кровь может быть антикоагулянтом ЭДТА, цитрат или гепарин. Так как они недолговечны, нейтрофилов следует использовать в течение 2-4 часов после сбора. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали к желаемой концентрации.

Если шесть полос не являются отдельными после первого шага центрифугирования, процесс разделения не была чистой и необходимо будет повторить. Для четкого разделения, убедитесь, что выделение средств массовой информации еще не истек, или загрязнены. Разделение может быть неудачным, если кровь донора потребляемого алкоголя или лекарств в 72 часов до забора крови.

Для предотвращения активации нейтрофилов во время процедуры разделения, то лучше использовать HBSS без Ca2 + / Mg2 +, так как ионы Было показано, что премьер клеток. Ресуспендирования гранул также должны быть выполнены медленно, и вихрь настройки должны храниться в низкой и средней дальности, так что клетки не активируются.

При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность. Чистота и жизнеспособность можно оценить с помощью маркировки клеток с нейтрофилами специфическим маркером CD66b и трипанового синего красителя исключения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Финансирование из NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
Нейтрофилов Изоляция протокола
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).More

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter