Summary
Neutrofila granulocyter är bland de första cellerna att anlända på platsen av inflammatoriska immunsvar, och deras funktioner och mekanismer har studerats utförligt in vitro. Vi visar en standard täthet gradient metod och separering att isolera humana neutrofiler från helblod med hjälp av kommersiellt tillgängliga separation medier.
Abstract
Neutrofila polymorfonukleära granulocyter (PMN) är de mest förekommande leukocyter hos människor och bland de första cellerna att anlända på platsen av inflammatoriska immunsvar. På grund av sin nyckelroll i inflammation, är neutrofila funktioner såsom förflyttning, cytokinproduktionen, fagocytos och tumörcellens bekämpa studerats. För att karakterisera specifika funktioner av neutrofiler, är en ren, snabb och tillförlitlig metod att skilja dem från andra blodkroppar önskvärd för in vitro-studier, särskilt eftersom neutrofiler är kortlivade och bör användas inom 2-4 timmar efter provtagning. Här visar vi en standard täthet gradient metod och separering att isolera humana neutrofiler från helblod med hjälp av kommersiellt tillgängliga separation media som är en blandning av natrium metrizoate och Dextran 500. Proceduren består av lager på lager helblod över densitetsgradient medium, centrifugering, separering av neutrofila lager, och lys av kvarvarande erytrocyter. Cellerna tvättas, räknas, och suspenderade i buffert till önskad koncentration. När de utförs på rätt sätt, har denna metod visat sig ge prov på> 95% neutrofiler med> 95% livskraft.
Protocol
Neutrofila Isolering Protokoll
- Låt alla reagenser till rumstemperatur.
- Samla 5,0 ml av neutrofila isolering media i centrifugrör. Försiktigt lager 5,0 ml blod över separationen media. Utför detta steg långsamt och försiktigt, och med pipettspetsen nära ytan av media för att undvika att blanda blod och media.
- Centrifugera vid 500 RCF för 35 minuter vid 20-25 ° C. Blodet bör skilja ut i sex olika band: plasma, monocyter, media isolering, neutrofiler, fler medier isolering, och röda blodkroppar pellet (Figur 1). Om dessa band är inte klart var separationsprocessen rena inte, och kommer att behöva upprepas.
- Ta försiktigt bort de tre översta skikt (plasma, monocyter och media isolering) med en pipett. Kassera dessa lager.
- Försiktigt pipett lagret av neutrofiler och alla isoleringen media under neutrofiler. Placera lösningen i en ren centrifugrör.
- Späd neutrofila lösningen till 10 ml med HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 +. Vänd röret några gånger för att avbryta cellerna.
- Centrifugera neutrofila lösningen vid 350 RCF i 10 minuter. En röd pellets bör vara närvarande i botten av röret, som innehåller neutrofiler och kvarvarande röda blodkroppar (RBC). Avlägsna supernatanten med en pipett försiktigt så att pellets inte störs.
- För att Lyse kvarvarande röda blodkropparna, tillsätt 2 ml Red Buffert cellslys till röret. För att suspendera pelleten, virveln flaskan med inställningen 3-4. Undvik att öka virveln inställning över 4, eftersom detta kan orsaka att neutrofiler för att aktivera. Det kan vara nödvändigt att virvel i flera sekunder, eller "puls" virveln att lös pelleten.
- Centrifugera röret vid 250 RCF för 5 min. Avlägsna supernatanten med pipett. Upprepa lyserings processen om det behövs.
- Tillsätt 500 l HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 + till varje rör. Återigen, vortex för att suspendera pelleten med inställningen 3-4. Späd till 10 ml med HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 +.
- Centrifugera rören vid 250 RCF för 5 min. Aspirera supernatanten och kassera.
- Återsuspendera pelleten i 250 l HBSS / HSA Lösning (2% HSA). Celler kan sedan räknas och justeras till önskad koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den densitetsgradient separation metod används för att isolera humana neutrofiler från helblod med en blandning av natrium metrizoate och Dextran 500. Denna metod är baserad på mononukleära leukocyter separation metod Boyum (1968) som var modifierade för neutrofila separation av Ferrante och Thong (1980).
Efter samling från en donator kan helblod ges antikoagulantia med EDTA, citrat eller heparin. Eftersom de är kortlivade, bör neutrofiler användas inom 2-4 timmar efter provtagning. Proceduren består av lager på lager helblod över densitetsgradient medium, centrifugering, separering av neutrofila lager, och lys av kvarvarande erytrocyter. Cellerna tvättas, räknad och återsuspenderade till önskad koncentration.
Om de sex banden inte är särskiljbara efter den första centrifugeringen steget var separationsprocessen inte ren och kommer att behöva upprepas. För rena separation, se till att isoleringen media inte har löpt ut eller förorenat. Separation kan också misslyckas om blodgivare har druckit alkohol eller mediciner i 72 timmar före provtagningen.
För att förhindra neutrofil aktivering under separationen förfarandet, är det bäst att använda HBSS utan Ca2 + / Mg 2 +, eftersom joner har visat sig prime celler. Resuspension av pellets bör också utföras långsamt och vortexa inställningar bör hållas i den aktiverade låga till mid-range, så att celler inte blir.
När de utförs på rätt sätt, har denna metod visat sig ge prov på> 95% neutrofiler med> 95% livskraft. Renhet och hållbarhet kan bedömas genom märkning cellerna med neutrofil-specifik markör CD66b och trypan blått färgämne utslagning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansiering från NIH R01 HL56621.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Poly(R) | Reagent | Cedarlane Labs | PolymorphprepTM can be used as an alternative | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen | ||
| Human Serum Albumin | Reagent | ZLB Bioplasma | ||
| Red Cell Lysis Buffer | Reagent | Roche Group | ||
| Centrifuge | Tool | |||
| Vortexer | Tool | |||
| Pasteur Pipettes and bulb | Tool | |||
| PolymorphprepTM | Reagent | Axis-Shield | Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R) | |
| Syringe Filter | Other | EMD Millipore | SLGV033RS | Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable |
| Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride | Reagent | Invitrogen |
References
- Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
- England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
- Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
- Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
