Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Nötrofil İzolasyon Protokolü

doi: 10.3791/745 Published: July 23, 2008

Summary

Nötrofiller inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasında olup, görevlerini ve mekanizmalar in vitro yoğun çalışmalar yapılmıştır. Biz piyasada bulunan ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir.

Abstract

Polimorfonükleer nötrofil granülositler (PMN), insanlarda ve inflamatuar immün yanıt sitesinde ulaşmak için ilk hücreleri arasındaki en bol lökosit vardır. Inflamasyon kilit rol nedeniyle, hareketlilik, sitokin üretimi, fagositoz ve tümör hücre mücadele gibi nötrofil işlevlerini yoğun olarak çalışılmaktadır. Nötrofil kısa ömürlü ve toplama 2-4 saat içinde kullanılması gereken bu yana özellikle nötrofil özel fonksiyonlar karakterize için diğer kan hücreleri ayırarak, temiz, hızlı ve güvenilir bir yöntem, in vitro çalışmalar için arzu edilir. Burada, piyasada bulunan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı ayırma medya kullanılarak, tam kan, insan nötrofil izole etmek için standart bir yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi göstermektedir. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılması ve kalıntı eritrositlerin parçalanması üzerine katman tam kan oluşur. Hücreler daha sonra, yıkanmış, sayılır ve istenilen konsantrasyon için tampon yeniden süspanse. Doğru yapıldığında, bu yöntem>>% 95 canlılığı% 95 nötrofil örnekleri verim görülmüştür.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nötrofil İzolasyon Protokolü

  1. Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirin.
  2. 5.0 ml santrifüj tüpüne nötrofil izolasyon medya toplayın. Ayrılması medya üzerindeki kan dikkatlice katman 5.0 ml. Yavaş ve dikkatli bir şekilde ve medya yüzeyine yakın kan ve medya karışmasını önlemek için pipet ile bu adımı gerçekleştirin.
  3. 20-25 dakika süreyle 35 500 RCF santrifüjleyin ° C Plazma, monositler, izolasyon medya, nötrofiller, daha fazla izolasyon medya ve kırmızı kan hücre pelletini (Şekil 1): kan, 6 farklı bölümlere ayırmalıdır. Bu bantları açık değilse, ayırma işlemi temiz değil ve tekrar edilmesi gerekecektir.
  4. Bir pipet kullanarak en üst üç katman (plazma, monositler ve izolasyon ortam) dikkatlice çıkarın. Bu katmanlar atın.
  5. Nötrofil ve nötrofil altındaki izolasyon medya katman dikkatlice pipetle. Çözüm temiz bir santrifüj tüpü içine yerleştirin.
  6. Ca 2 + Mg / 2 + olmadan HBSS nötrofil çözeltinin 10 ml. Hücreleri askıya alma tüpü birkaç kez ters çevirin.
  7. 10 dakika için 350 RCF nötrofil çözüm santrifüjleyin. Kırmızı bir pelet nötrofil ve kalan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) içeren tüpün alt kısmında mevcut olmalıdır. Dikkatle pelet rahatsız olmadığını ifade eden bir pipet ile süpernatantı.
  8. Kalan eritrositlerde lyse için tüpe 2 ml Kırmızı Hücre Lizis Tampon ekleyin. Pelet, vorteks bir ayarda 3-4 flakon tekrar süspansiyon. Nötrofil aktive neden olabilir bu yana, 4 yukarıdaki vorteks ayarını artırarak kaçının. Birkaç saniye vorteks için gerekli olabilir, ya da pelet çözmek için vorteks "darbe".
  9. 5 dakika boyunca 250 RCF tüp santrifüjleyin. Pipet ile süpernatantı. Gerekirse parçalama işlemi tekrarlayın.
  10. Ca 2 + Mg / 2 olmadan 500 ul HBSS ekle + Her bir tüp . Yine, bir ayarda 3-4 pelletini tekrar karıştırın. Ca 2 + Mg / 2 + olmadan HBSS ile 10 ml ye tamamlanır.
  11. 5 dakika boyunca 250 RCF tüpler santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve atın.
  12. 250 ul HBSS / HSA Çözüm (2% HSA) pelletini tekrar. Hücreler daha sonra sayılır ve istenilen konsantrasyon için ayarlanmış olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yoğunluk gradiyenti ayırma yöntemi tam kan sodyum metrizoate ve Dextran'ın 500 karışımı kullanarak insan nötrofil izole etmek için kullanılır. Bu yöntem, nötrofil ayrılması için Ferrante ve Thong (1980) tarafından güncellenmiştir Boyum (1968) tarafından mononükleer lökosit ayırma yöntemi dayanıyor.

Bir bağış toplama sonra, tam kan, EDTA, sitrat veya heparin ile antikoagüle olabilir. Kısa ömürlü olduğundan, nötrofil toplama 2-4 saat içinde kullanılmalıdır. Prosedür yoğunluk gradiyenti orta, santrifüj, nötrofil tabakasının ayrılması ve kalıntı eritrositlerin parçalanması üzerine katman tam kan oluşur. Hücreler daha sonra, yıkanmış, sayılır ve istenilen konsantrasyon için yeniden süspanse.

Altı bantları ilk santrifüj adımdan sonra farklı değilse, ayırma işlemi temiz değil ve tekrar edilmesi gerekecektir. Temiz ayrılması için izolasyon medya süresi dolmuş veya kontamine olmadığından emin olun. Kan bağışı, kan toplama öncesinde 72 saat içinde tüketilen alkol ya da ilaç varsa Ayırma de başarısız olabilir.

Ayırma işlemi sırasında nötrofil aktivasyonu önlemek için, Ca2 olmadan HBSS kullanmak en iyisidir + / Mg2 + iyonları asal hücrelere beri. Pelet tabanda da yavaş yavaş yapılabilir, ve vorteks ayarları düşük ila orta sınıf, böylece hücreleri haline değilsiniz aktif tutulmalıdır.

Doğru yapıldığında, bu yöntem>>% 95 canlılığı% 95 nötrofil örnekleri verim görülmüştür. Saflık ve canlılığı hücreleri nötrofil-spesifik bir işaretleyici CD66b ve tripan mavi boya dışlama ile etiketleme tarafından değerlendirilecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

NIH R01 HL56621 fon.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).
Nötrofil İzolasyon Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).More

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter