Summary
כאן אנחנו מראים השיטה שלנו לבודד אפידרמיס עכבר לתאי גזע עצביים לפסגה (EPI-NCSC). טכניקה מערבת מיקרו לנתח זקיקי השערה, בידוד בליטה ו placeing אותו בתרבית רקמה. EPI-NCSC להתחיל להגר explants בליטה על גבי תשתית בתוך 3-4 ימים.
Abstract
EPI-NCSC הם שרידי רכס עובריים עצביים במיקום מבוגר, את הבליטה של זקיקי השיער. הם בתאי גזע multipotent כי יש את המאפיין הפיזיולוגי ליצור מגוון רחב של סוגי תאים מובחנים, כולל נוירונים, תאים תומכים עצב, לתאי שריר חלק, עצם / סחוס תאים מלנוציטים. EPI-NCSC נגישים בקלות בעור שעיר ניתן לבודד כאוכלוסייה טהור מאוד בתאי גזע. וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת עכבר EPI-NCSC תרבויות מן זקיקי השערה. כרית זיף של עכבר בוגר מוסר, ועל זקיקי השערה גזור. זקיקים הם ואז לחתוך longitudinally ובהמשך רוחבי מעל ומתחת לאזור בליטה. בליטה יוסר הקפסולה קולגן להציב צלחת תרבות. EPI-NCSC להתחיל להגר מן explants בליטה 3 עד 4 ימים מאוחר יותר.
Protocol
Dissection הבליטה של זקיקי השערה למבוגרים עכבר
- אנו משתמשים 10 שבועות עד 6 חודשים עכברים ישנים. עכברים צעירים לעתים קרובות להניב יותר תאים. עכבר להרדים בעלי חיים לצלול לתוך התערובת כולה 01:01 של בבטאדין (פתרון יוד) ואת מי חמצן (זמין בתי מרקחת) למשך כ 3 דקות.
- עכבר Squirt כולו, במיוחד באזור הפנים, עם 75% אתנול, ולבצע העכבר כדי מיקרוסקופ לנתיחה במנדף זרימה למינרית.
- לנתח רפידות זיף, נמנע מלהביט אל תוך חיתוך פקעות שיער, בריכה HBSS.
- לנתח זקיקי השערה ואת הבריכה HBSS בטמפרטורת החדר. לעשות זאת על ידי החזקת העור ליד זקיקי השיער עם מלקחיים, ולאחר מכן חיתוך סביב זקיק עם מספריים ישר. גזור עמוק כדי למנוע פציעה של נורות השיער.
- הרם זקיק השערה מתוך פנקס זיף והכניסו צלחת חדשה עם HBSS טריים.
- פלאש adipous רפוי רקמות עורי עם מתיז של חיץ, עד זקיקי השערה נקיות. במידת הצורך, לחתוך החוצפה זקיק השערה ולהסיר רקמה חסיד באמצעות גירוד גלי חוזרות ונשנות של HBSS.
- פין follilce שיער נקי על צלחת Sylgard מצופה זכוכית פטרי באמצעות מחטים טונגסטן חידד, באמצעות microforceps עבור ולהחזיק בחלק העור ליד הזקיק.
- גזור זקיק השערה longitudically עם microblade. הימנע חיתוך עמוק מדי, כמו זה יהיה לפגוע בליטה. הסר הדם משפריץ חוזרות ונשנות של HBSS עד נעלם. מראה של דם היא אינדיקציה טובה כי לחתוך היה עמוק מספיק. אם לחתוך longitudial אינו ארוך מספיק, זה עשוי להיות מוארך עם microscissors כפופות.
- ביצוע חתך רוחבי מעל לרמה של הסינוס החלול ולאחר מכן חתך רוחבי השני ברמת בתוך בסינוסים את הטבעת, קרוב לעור.
- כעת תראה את הבליטה בתוך הקפסולה.
- תפוס קץ של קולגן כדי הקפסולה עם מלקחיים ו לרדד את הבליטה באמצעות מחט טונגסטן כפופות. כעת תראה את הקפסולה ריק את הבליטה מבודדים.
- בריכת מבודד בליטות צלחת תרבות נפרדת HBSS בטמפרטורת החדר. ודא שאין רקמות אחרות היא זיהום בליטות ונקווה.
תרבות Explants בליטה
- מעיל 35 מ"מ תרבות צלחות עם קולגן על ידי הצבת 50 μl קולגן ו 10 μl NaCl 6% סטרילי אחד ליד השני. מערבבים היטב עם pipet Pasteyr פעמיים כפוף לדחוף לכיוון שולי הצלחת התרבות. דגירה לילה dessicator נקי, אבל לא נותנים יבש. לפני השימוש, יש לשטוף את הצלחות עם מי מלח.
- טרום דגירה תרבות צלחות קולגן מצופה ושטף של כ 3 שעות עם המדיום לתרבות. בינוני תרבות מורכבת של 85% אלפא שונה מ, 10% בסרום שור העובר 5% 11 יום חומוס לחלץ העובר.
- לאחר דגירה מחדש, להסיר בינוני תרבות מהצלחות ולהוסיף בליטות עם מספר בינוני כמה שפחות. הסר בינוני תרבות עודף.
- דגירה עבור שעה 1, אבל לא יותר, בתא האינקובטור באווירה humidified עם חמצן 10% ו 5% CO 2.
- אחרי שעה 1, בעדינות להוסיף 1.5 מ"ל של מדיום תרבות. Explants הבליטה צריך לדבוק לתשתית קולגן. החלף 50% של המדיום תרבות יומי.
- תוך 3 - 4 ימים, התאים לנדוד יהיה להגר מן explants בליטה. הערה מורפולוגיה stellate שלהם, תנועתיות, והיעדר בולט של תאים תאים קשר. במהלך הימים הקרובים, יותר תאים יהיה להגר, והיגר התאים יתרבו במהירות.
- הסרת בליטה 2-3 ימים לאחר תחילתה של הגירה EPI-NCSC עם מחט טונגסטן חידד. אם בליטות נשארים זמן רב יותר, הם נוטים לשטח ולעשות את זה אי אפשר להשיג טהור EPI-NCSC תרבויות.
- חשוב: תאים נדירים עם מורפולוגיה שטוח, אשר יתברר לפעמים כמה ימים מאוחר יותר EPI-NCSC, ואלו פחות ניעתי הם לא EPI-NCSC, אבל המשוערת בתאי גזע אפידרמיס / אבות. תרבויות המורכב של התאים האלה, או תרבויות מעורבות המכילות EPI-NCSC ו המשוערת בתאי גזע אפידרמיס / אבות צריכים להיות מבוטלים.
- רמז: אין לשמור את התאים במשך זמן רב מדי במדיום explant העיקרי, כפי שהם נוטים להבחין במהירות על צפיפות התאים גבוהה, לכאורה בשל איתות autocrine / אוטוקריני גורם הגדילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזכות יכולת הנדידה שלהם, EPI-NCSC ניתן לבודד כאוכלוסייה טהור מאוד בתאי גזע, אשר ניתן להרחיב במבחנה. כמו שרידים עובריים במיקום מבוגר, EPI-NCSC הם מועמדים אטרקטיבית פוטנציאלית לעתיד החלפת טיפולים התא, הנדסה ביו ו / או רפואה רגנרטיבית. בדקנו EPI-NCSC במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה, שם הם מראים תכונות רצויות. באמצעות פרופיל גנטי ביטוי על ידי LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / גיאו, מספר סדרה GSE4680) הראינו כי, כצפוי, תאים עובריים עצביים לפסגה EPI-NCSC חולקים גנים דומים ביטוי דפוס שונה מזו של השכן בתאי גזע אפידרמיס אחרים תושב עור לתאי גזע / אבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
נתמך על ידי: USPHS מענק NS38500, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, NIH, ארה"ב; הברית ביו טכנולוגיה של מזרח ויסקונסין, Milwauke, וויסקונסין, ארה"ב; Bryon Riesch שיתוק קרן מילווקי, וויסקונסין, ארה"ב; סדר אחווה של הנשרים, פרק התיכון , ארה"ב; הלאומי פגיעה בחוט השדרה האגודה, פרק במילווקי, ארה"ב, צפון מזרח אנגליה לתאי גזע המכון, אוניברסיטת ניוקאסל, אנגליה.
References
- Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Sieber-Blum, M., Grim, M. The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells. Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).
- Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord. Pub. 32, 67-81 (2006).
- Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature. Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).
