Мышь эпидермального нервного гребня стволовых клеток (EPI-NCSC) Культур

Summary

Здесь мы показываем наш метод, чтобы изолировать мыши эпидермального нервного гребня стволовые клетки (EPI-NCSC). Техника включает в себя микро-рассечение усов фолликулов, изолируя выпуклость и placeing его в культуре ткани. EPI-NCSC начинают эмигрировать из выпуклости эксплантов на субстрате в течение 3 - 4 дня.

Abstract

EPI-NCSC остатки эмбрионального нервного гребня у взрослого человека месте, выпуклость волосяных фолликулов. Они мультипотентных стволовых клеток, которые имеют физиологическое свойство генерировать широкий спектр дифференцированных типов клеток, включая нейроны, нервные опорные клетки, клетки гладкой мышцы, кости / хрящевых клеток и меланоцитов. EPI-NCSC были легко доступны в волосатой кожи и могут быть выделены в виде высокой чистой популяции стволовых клеток. Это видео содержит подробный протокол для подготовки мыши EPI-NCSC культур от усов фолликулов. Усов площадке взрослой мыши удаляется, а усов фолликулов расчленены. Фолликулы затем разрезают вдоль и поперек впоследствии выше и ниже выпуклость регионе. Выпуклость удаляется из коллагена капсулы и помещены в культуре пластины. EPI-NCSC начинают эмигрировать из выпуклости эксплантов от 3 до 4 дней.

Protocol

Препарирование дуге от взрослых Фолликулы Whisker мышь

1. Мы используем 10 недель до 6 месяцев мышей. Младший мышей часто дают более ячеек. Эвтаназии мыши и погрузить весь животного в смеси 1:1 бетадин (раствор йода) и перекись водорода (доступный из аптеки) в течение 3 минут.
   
2. Squirt все мыши, особенно лицевой области, с 75% этанола, и нести мыши рассечение микроскоп в ламинарном потоке капот.
3. Рассеките подушечками усов, тщательно избегая резки в волосяных луковиц, и бассейн в HBSS.
4. Рассеките усов фолликулов и бассейн в HBSS при комнатной температуре. Этого, удерживая кожу рядом с волосяной фолликул с щипцами, а затем резки вокруг фолликула с прямыми ножницами. Вырезать глубоко, чтобы не повредить волосяные луковицы.
5. Поднимите усов фолликула из усов площадку и введены в новой пластинкой со свежими HBSS.
6. Флеш свободные adipous и кожной ткани с впрыскивает буфера, пока фолликул усов чисты. В случае необходимости, сократить нерва усов фолликула и удалить приверженцем ткани, очищая и повторил приливы HBSS.
7. Pin чистой follilce волосы на Sylgard-стекла с покрытием чашку Петри использованием заостренными иглами вольфрама, используя microforceps для проведения на кожу части рядом с фолликула.
8. Вырезать усов фолликула longitudically с MicroBlade. Избегайте резки слишком глубоко, так как это повредит выпуклость. Удалить крови при повторных впрыскивает в HBSS, пока нет. Появление крови является хорошим показателем того, что сокращение было достаточно глубоко. Если продольного разреза не является достаточно долго, это может быть увеличена с согнутыми microscissors.
9. Сделать поперечный разрез над уровнем кавернозном синусе, а затем второй поперечный разрез на уровне в пределах кольца пазухи, близко к коже.
10. Теперь вы увидите выступ внутри капсулы.
11. Захватите конец коллагена капсула с пинцетом и вывозе с выпуклостью изогнутые иглы вольфрама. Теперь вы увидите пустые капсулы и изолированных выпуклость.
12. Бассейн изолированных выпуклости в отдельную табличку культуры в HBSS при комнатной температуре. Убедитесь, что никакие другие ткани загрязняющих объединенных выпуклостями.

Культура выпуклость эксплантов

1. Пальто 35 мм культуры пластин с коллагеном, разместив 50 мкл коллагена и 10 мкл стерильной 6% NaCl рядом друг с другом. Хорошо перемешайте с двойным согнуты пипетки Pasteyr и толчок к краю культуры пластины. Инкубируйте ночь в чистой эксикаторе, но не дайте высохнуть. Перед использованием промойте пластины с раствором.
2. Предварительно инкубировать коллагена покрытием и промывать культуры пластин в течение примерно 3 часов с питательной среды. Культура среда состоит из 85% Альфа-модифицированный MEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% в день 11 куриного эмбриона экстракта.
3. После повторной инкубации удалить культуральной среды от плиты и добавить несколько выпуклостей с минимальным среде, как это возможно. Удалите излишки питательной среды.
4. Инкубируйте в течение 1 часа, но не дольше, в ячейке инкубатор во влажной атмосфере с 10% кислорода и 5% СО _2.
5. Через 1 час, осторожно добавить 1,5 мл питательной среды. Дуге эксплантов должны придерживаться коллагена субстрата. Замените 50% культуральной среде в день.
6. В течение 3 - 4 дня, далеко мигрирующих клетках будут эмигрировать из выпуклости эксплантов. Обратите внимание, их звездчатых морфологии, подвижности и преобладающим отсутствие межклеточных контактов. В течение следующих нескольких дней, больше клеток будет эмигрировать, и эмигрировал клетки размножаются быстро.
7. Удалить выпуклость 2 - 3 дней после начала EPI-NCSC эмиграции с заостренным вольфрамовой иглы. Если выпуклость остаются дольше, они, как правило, чтобы сгладить и сделать невозможным получение чистой EPI-NCSC культур.
8. Важно: Редкие клетки с уплощенной морфологии, которые становятся очевидными иногда несколько дней позже, чем EPI-NCSC, а какие менее подвижны НЕ EPI-NCSC, но предполагаемый эпидермальных стволовых клеток / прародителей. Культур, состоящий из этих клеток, или смешанные культур, содержащих EPI-NCSC и предполагаемые стволовые клетки эпидермиса / прародители должны быть отброшены.
9. Совет: не держать клетки слишком долго в основной средой эксплантатов, поскольку они имеют тенденцию дифференцироваться быстро при высокой плотности клеток, предположительно из-за аутокринной / паракринной сигнализации фактора роста.

Discussion

В силу их миграционных способностей, EPI-NCSC могут быть выделены в виде высокой чистой популяции стволовых клеток, которая может быть расширена в пробирке. Как эмбриональных остатков во взрослом месте, EPI-NCSC являются потенциально привлекательными кандидатами для будущей замены клеток терапии, биомедицинской инженерии и / или регенеративной медицины. Мы протестировали EPI-NCSC в мышиной модели повреждения спинного мозга, где они показывают желаемые черты. Через экспрессии генов профилирования по LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / гео, серийный номер GSE4680) мы показали, что, как и ожидалось, эмбриональные нервные клетки гребня и EPI-NCSC доля Аналогичная картина экспрессии генов, что отличается от соседних эпидермальных стволовых клеток и других кожных резидент стволовых клеток / прародителей.