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Biology

माउस Epidermal तंत्रिका शिखा स्टेम सेल (महामारी NCSC) संस्कृति

doi: 10.3791/772 Published: May 9, 2008

Summary

यहाँ हम अपने विधि माउस epidermal तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं (महामारी NCSC) को अलग दिखा. तकनीक शामिल माइक्रो विदारक गलमुच्छा रोम, उभाड़ अलग और यह टिशू कल्चर में placeing. 4 दिन - महामारी - NCSC 3 भीतर बुनियाद पर उभाड़ explants से उत्प्रवास शुरू.

Abstract

महामारी - NCSC एक वयस्क स्थान, बालों के रोम के उभाड़ना में भ्रूण तंत्रिका शिखा के अवशेष हैं. वे multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि शारीरिक संपत्ति है विभेदित सेल प्रकार की एक विस्तृत सरणी न्यूरॉन्स, तंत्रिका कोशिकाओं का समर्थन, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, अस्थि / उपास्थि कोशिकाओं और melanocytes सहित उत्पन्न कर रहे हैं. महामारी - NCSC बालों त्वचा में आसानी से सुलभ हैं और स्टेम सेल के एक उच्च शुद्ध जनसंख्या के रूप में अलग किया जा सकता है. इस वीडियो गलमुच्छा रोम से माउस महामारी NCSC संस्कृतियों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. एक वयस्क चूहे के गलमुच्छा पैड हटा दिया है, और गलमुच्छा रोम dissected. रोम तो उभाड़ना क्षेत्र के ऊपर और नीचे हैं longitudinally और transversely बाद में कटौती. उभाड़ना कोलेजन कैप्सूल से हटा दिया है और एक संस्कृति की थाली में रखा जाता है. महामारी - NCSC उभाड़ना explants से 3 से 4 दिनों के बाद उत्प्रवास शुरू करते हैं.

Protocol

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वयस्क माउस गलमुच्छा रोम से उभाड़ के विच्छेदन

  1. हम 10 से सप्ताह से 6 महीने पुराने चूहों का उपयोग करें. युवा चूहों अक्सर अधिक कक्षों उपज. Betadine (आयोडीन समाधान) और के बारे में 3 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड (फार्मेसी से उपलब्ध है) के 01:01 मिश्रण में माउस और डूब पूरे जानवर euthanize.
  2. धार पूरे माउस, विशेष रूप से चेहरे क्षेत्र के 75% इथेनॉल के साथ, और लामिना का प्रवाह हुड में विच्छेदन खुर्दबीन के लिए माउस ले.
  3. गलमुच्छा पैड काटना, ध्यान से बाल बल्ब में कटौती, और HBSS में पूल से परहेज.
  4. कमरे के तापमान पर HBSS गलमुच्छा रोम और पूल में काटना. त्वचा पकड़े बाल कूप करने के लिए अगले एक संदंश के साथ, और फिर सीधे कैंची के साथ कूप के आसपास काटने के द्वारा इस करो. गहरा कट बाल बल्ब घायल से बचने.
  5. गलमुच्छा कूप लिफ्ट गलमुच्छा पैड के बाहर और ताजा HBSS के साथ नई प्लेट में डाल दिया.
  6. बफर के squirts के साथ ढीला adipous और त्वचीय ऊतकों फ्लश, जब तक गलमुच्छा रोम साफ कर रहे हैं. यदि आवश्यक हो, गलमुच्छा कूप तंत्रिका कटौती और scraping और HBSS के दोहराया flushes द्वारा पक्षपाती ऊतक निकालने.
  7. Sylgard लेपित गिलास पेट्री तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग पकवान पर साफ बालों follilce पिन, त्वचा भाग पर कूप को आगे रखने के लिए microforceps का उपयोग कर.
  8. कट गलमुच्छा microblade के साथ longitudically कूप. काटने भी गहराई से बचें, के रूप में इस उभाड़ना घायल होगा. HBSS के दोहराया squirts जब तक चला गया के साथ खून निकालें. रक्त के रूप में एक अच्छा संकेत है कि कटौती काफी गहरी थी. यदि longitudial कटौती लंबे समय पर्याप्त नहीं है, यह तुला microscissors के साथ lengthened किया जा सकता है.
  9. गुफाओंवाला साइनस के स्तर से ऊपर एक अनुप्रस्थ काट और बाद में अंगूठी साइनस भीतर स्तर पर एक दूसरे अनुप्रस्थ कटौती, त्वचा के करीब है.
  10. अब आप कैप्सूल के अंदर उभाड़ना देखेंगे.
  11. संदंश के साथ कोलेजन कैप्सूल करने के लिए एक अंत ले लो और एक तुला टंगस्टन सुई के साथ उभाड़ना बाहर रोल. अब आप खाली कैप्सूल और पृथक उभाड़ना देखेंगे.
  12. पूल कमरे के तापमान पर HBSS में एक अलग संस्कृति की थाली में bulges पृथक. सुनिश्चित करें कि कोई अन्य ऊतक जमा bulges contaminating है.

उभाड़ना Explants की संस्कृति

  1. 50 μl कोलेजन और 10 μl बाँझ 6% एक दूसरे के बगल NaCl रखकर कोलेजन के साथ 35 मिमी संस्कृति प्लेटों कोट. एक डबल तुला Pasteyr pipet के साथ अच्छी तरह से मिलाएं और संस्कृति की थाली के किनारे की ओर धक्का. एक साफ dessicator में रातोंरात सेते हैं, लेकिन सूखी नहीं. उपयोग करने से पहले, नमक के साथ प्लेटें कुल्ला.
  2. पूर्व सेते कोलेजन लेपित और rinsed संस्कृति के माध्यम से लगभग 3 घंटा के लिए संस्कृति प्लेटों. संस्कृति मध्यम 85% अल्फा संशोधित सदस्य, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% दिन 11 लड़की भ्रूण निकालने के होते हैं.
  3. फिर से ऊष्मायन के बाद, प्लेटों से संस्कृति के माध्यम हटाने और संभव के रूप में के रूप में थोड़ा मध्यम के साथ कई bulges जोड़ने. अतिरिक्त संस्कृति के माध्यम निकालें.
  4. 1 घंटे के लिए सेते हैं, लेकिन नहीं अब, सेल इनक्यूबेटर में 10% ऑक्सीजन और 5% सीओ 2 के साथ एक humidified माहौल में.
  5. 1 घंटे के बाद, धीरे मध्यम संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. उभाड़ना explants कोलेजन बुनियाद का पालन करना चाहिए. संस्कृति के माध्यम के 50% दैनिक बदलें.
  6. तीन के भीतर - 4 दिन, बहुत ही प्रवासी कोशिकाओं उभाड़ना explants से उत्प्रवास जाएगा. उनके तारामय आकारिकी, गतिशीलता, और सेल सेल संपर्क के प्रमुख अभाव नोट. अगले कुछ दिनों में, और अधिक कोशिकाओं उत्प्रवास, और प्रवास कोशिकाओं तेजी से पैदा होगा.
  7. महामारी - NCSC उत्प्रवास के एक तेज टंगस्टन सुई के साथ शुरुआत के बाद 3 दिन - 2 उभाड़ना निकालें. यदि bulges अब छोड़ दिया जाता है, वे समतल और शुद्ध महामारी NCSC संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए यह असंभव बनाने के लिए करते हैं.
  8. महत्वपूर्ण: चपटा आकारिकी, है जो कभी कभी स्पष्ट कई दिनों के बाद महामारी NCSC की तुलना में हो जाते हैं और जो के साथ दुर्लभ कोशिकाओं को कम गतिशील होते हैं महामारी - NCSC नहीं हैं, लेकिन ख्यात epidermal स्टेम कोशिकाओं / progenitors. इन कोशिकाओं से मिलकर संस्कृतियों, या मिश्रित संस्कृतियों महामारी NCSC और ख्यात epidermal स्टेम कोशिकाओं / progenitors युक्त त्याग की जरूरत है.
  9. सुझाव: प्राथमिक explant मध्यम में भी लंबे समय के लिए कोशिकाओं को रखने के लिए, के रूप में वे उच्च घनत्व सेल में तेजी से अंतर / autocrine paracrine वृद्धि कारक सिगनल के कारण putatively करते हैं.

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Discussion

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उनके प्रवासी क्षमता के पुण्य से, महामारी NCSC स्टेम सेल, जो इन विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है की एक उच्च शुद्ध जनसंख्या के रूप में अलग किया जा सकता है. एक वयस्क स्थान में भ्रूण अवशेष के रूप में, महामारी NCSC भविष्य सेल प्रतिस्थापन उपचार, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग और / या पुनर्योजी चिकित्सा के लिए संभावित आकर्षक उम्मीदवारों रहे हैं. हम रीढ़ की हड्डी में चोट के एक माउस मॉडल में महामारी NCSC का परीक्षण किया है, जहां वे वांछनीय लक्षण दिखाने. हम LongSAGE (/ www.ncbi.nlm.nih.gov भू, श्रृंखला GSE4680 संख्या) द्वारा जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के माध्यम से पता चला है कि, के रूप में की उम्मीद है, भ्रूण तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और महामारी के NCSC एक समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न है कि पड़ोसी से अलग हिस्सा epidermal स्टेम कोशिकाओं और अन्य त्वचा निवासी स्टेम कोशिकाओं / progenitors.

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Acknowledgments

द्वारा समर्थित है, साउथईस्टर्न विस्कॉन्सिन बायोमेडिकल प्रौद्योगिकी एलायंस, Milwauke, WI, संयुक्त राज्य अमेरिका, Bryon Riesch पक्षाघात फाउंडेशन, Milwaukee, WI, संयुक्त राज्य अमेरिका, ईगल्स के सहोदर आदेश, मिडवेस्ट अध्याय USPHS अनुदान NS38500, मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक, एनआईएच, संयुक्त राज्य अमरीका: , संयुक्त राज्य अमेरिका, राष्ट्रीय स्पाइनल कॉर्ड चोट एसोसिएशन, मिलवॉकी अध्याय, संयुक्त राज्य अमेरिका, पूर्वोत्तर इंग्लैंड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट, न्यूकासल विश्वविद्यालय, ब्रिटेन.

References

  1. Sieber-Blum, M., Grim, M., YF, H. u, Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
  2. Sieber-Blum, M., Grim, M. The adult hair follicle - cradle for pluripotent neural crest stem cells. Birth Defects Research (Part C). Tuan, R., Grim, M. 72, 162-172 (2004).
  3. Sieber-Blum, M., Schnell, L., Grim, M., Schneider, R., Schwab, M. E. Characterization of epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) grafts in the lesioned spinal cord. Pub. 32, 67-81 (2006).
  4. Hu, Y. F., Zhang, Z. -J., Sieber-Blum, M. An epidermal neural crest stem cell (EPI-NCSC) molecular signature. Stem Cells. 24, Epub ahead of print 2692-2702 (2006).
माउस Epidermal तंत्रिका शिखा स्टेम सेल (महामारी NCSC) संस्कृति
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Sieber-Blum, M., Hu, Y. Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures. J. Vis. Exp. (15), e772, doi:10.3791/772 (2008).More

Sieber-Blum, M., Hu, Y. Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures. J. Vis. Exp. (15), e772, doi:10.3791/772 (2008).

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