小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI的非公务员合约雇员）文化

Summary

在这里，我们显示我们的方法分离出小鼠表皮神经嵴干细胞（EPI的非公务员合约雇员）。技术涉及微解剖胡须毛囊，孤立的隆起和placeing组织培养。 EPI的非公务员合约开始从到底层的隆起植移民，在3 - 4天。

Abstract

EPI的非公务员合约雇员是在成人的位置，毛囊隆起的胚胎神经嵴的残余。他们是多能干细胞具有产生分化的细胞类型广泛，包括神经元，神经细胞，平滑肌细胞，骨/软骨细胞和黑色素细胞的生理属性。 EPI的非公务员合约雇员在毛茸茸的皮肤很容易访问的，并可以作为分离出高纯度的干细胞人口。此影片提供了一个详细的协议，准备从鼠标EPI的非公务员合约雇员的文化胡须毛囊。成年小鼠触须垫被删除，和胡须毛囊解剖。卵泡然后切横纵向和随后的上方和下方的凸起区域。凸起是从胶原蛋白胶囊，并在培养板中。 EPI的非公务员合约雇员3至4天后开始隆起植移民。

Protocol

从成年鼠晶须卵泡凸出的剖析

1. 我们使用10个星期到6个月大的老鼠。年轻的老鼠经常会产生更多的细胞。鼠标和淹没整个动物安乐死成1:1的优碘（碘伏溶液）和过氧化氢，约3分钟（从药房）的混合物。
   
2. 水枪整个鼠标，特别是面部的地区，用75％乙醇，并进行鼠标在层流罩夹层显微镜。
3. 解剖晶须垫，小心地避免切成头发灯泡的HBSS池。
4. 在室温下的HBSS解剖胡须毛囊和游泳池。控股皮肤毛囊与镊子，然后周围的毛囊与直剪切割。切深刻地避免伤害头发灯泡。
5. 提起胡须毛囊触须垫，并投入到新盘，新鲜的HBSS。
6. 冲洗缓冲鞘松动adipous和真皮组织，直到胡须毛囊是干净的。如果有必要，切断神经晶须卵泡和删除刮和重复刷新的HBSS壁组织。
7. 引脚到干净头发follilce Sylgard镀膜玻璃的Petri用削尖的钨针盘，使用在皮肤上部分毛囊旁边microforceps。
8. 剪下胡须毛囊longitudically用microblade。避免切割得太深，因为这将损害隆起。删除重复，直至消失的HBSS鞘的血。血的外观是一个很好的迹象，削减不够深。如果longitudial削减不够长，可以延长弯曲microscissors。
9. 请海绵窦水平以上的横向剪切和随后的第二个在环鼻窦内的水平横向切割，紧贴皮肤。
10. 现在您将看到的隆起内囊。
11. 抓斗的胶原蛋白胶囊镊子和卷出弯曲的钨针的隆起。现在您将看到的空胶囊和孤立的隆起。
12. 池隔离在一个单独培养板在室温下的HBSS凸起。确保没有其他的组织是污染汇集的凸起。

文化隆起植

1. 35毫米与胶原蛋白的培养皿放置50μL的胶原蛋白和10μL无菌6％的NaCl彼此相邻的大衣。混合双弯曲Pasteyr吸管和推向培养板的边缘。孵育过夜，在一个干净的dessicator，但不要让干。使用前，用生理盐水冲洗板块。
2. 预孵化胶原蛋白涂层和冲洗约3小时培养基的培养皿。培养基组成的85％，10％胎牛血清和5％，11天的鸡胚提取物阿尔法改性MEM。
3. 重新孵化后，从板块中删除的培养基，添加尽可能少的中等几个凸起。删除多余的培养基。
4. 孵育1小时，但不能长时间在细胞培养箱，在10％的氧气和5％的CO ₂饱和湿度。
5. 1小时后，轻轻的培养基中加入1.5毫升。价格猛涨外植体，要坚持以胶原蛋白基质。每天更换培养液的50％。
6. 3 - 4天之内，高度洄游细胞将移民从隆起植。请注意星状的形态，运动，细胞与细胞接触的占主导地位的情况下。在接下来的几天，更多的细胞将移民，移民细胞会迅速增殖。
7. 发病后的计划免疫，非公务员合约雇员的移民用削尖的钨针取出隆起2 - 3天。如果留下较长的凸起，他们趋向扁平化，并使其无法获得纯净的计划免疫，非公务员合约雇员的文化。
8. 重要事项：扁平化形态，成为有时明显比EPI -非公务员合约雇员数天后，和稀有细胞不太能动 ，不EPI的非公务员合约雇员，但公认的表皮干细胞/祖细胞。文化，这些细胞组成的，或含EPI的非公务员合约雇员和公认的表皮干细胞/祖细胞混合培养的需要被丢弃。
9. 提示：不要让细胞在小学外植体介质太长，因为他们往往​​迅速分化，在高密度，公认是由于自分泌/旁分泌生长因子的信号。

Discussion

凭借其迁徙的能力，可以分离出高纯度的干细胞可以在体外培养扩增人口EPI的非公务员合约。作为在一个成人的位置胚胎残余，EPI -非公务员合约是为未来的细胞替代疗法，生物医学工程和/或再生医学的潜在吸引力的候选人。我们已经测试了EPI的非公务员合约雇员在脊髓损伤小鼠模型，它们显示的地方的理想特性。通过LongSAGE（www.ncbi.nlm.nih.gov / GEO，序列号GSE4680）的基因表达图谱，我们表明，正如所料，胚胎神经嵴细胞和EPI -非公务员合约有着相似的基因表达模式，从邻近不同表皮干细胞和其他皮肤居民干细胞/祖细胞。