Muis Epidermale neurale lijst Stem Cell (EPI-NCSC) culturen

Summary

Hier laten we onze methode om de muis epidermale neurale stamcellen (EPI-NCSC) te isoleren. Techniek houdt in micro-ontleden whisker follikels, het isoleren van de verdikking en placeing het in weefselkweek. EPI-NCSC beginnen om van uitstulping explantaten op de ondergrond emigreren binnen 3 - 4 dagen.

Abstract

EPI-NCSC zijn overblijfselen van de embryonale neurale lijst in een volwassen locatie, de uitstulping van de haarfollikels. Ze zijn multipotente stamcellen die de fysiologische eigenschap een breed scala van gedifferentieerde celtypen, waaronder neuronen, zenuwcellen ondersteunen van cellen, gladde spiercellen, bot / kraakbeen cellen en melanocyten te genereren. EPI-NCSC zijn gemakkelijk toegankelijk in de behaarde huid en kan worden geïsoleerd als een zeer zuivere populatie van stamcellen. Deze video geeft een gedetailleerd protocol voor het bereiden van de muis EPI-NCSC culturen uit whisker follikels. De snorhaar pad van een volwassen muis is verwijderd, en snorhaar follikels ontleed. De follikels worden dan de lengte en vervolgens dwars doorgesneden boven en onder de bobbel regio. De bobbel is verwijderd uit het collageen capsule en in een petrischaal. EPI-NCSC beginnen om te emigreren uit de uitstulping explantaten 3 tot 4 dagen later.

Protocol

Dissectie van de Ardennen tegen Adult Mouse Whisker Follikels

1. We maken gebruik van 10 weken tot 6 maanden oude muizen. Jongere muizen vaak opbrengst meer cellen. Euthanaseren muis en dompel hele dier in 1:1 mengsel van betadine (jodium-oplossing) en waterstofperoxide (verkrijgbaar bij apotheek) voor ongeveer 3 minuten.
   
2. Squirt hele muis, in het bijzonder het gezicht regio, met 75% ethanol, en draag muis om dissectie microscoop in laminaire flow kap.
3. Ontleden snorhaarkussentjes, zorgvuldig vermeden snijden in haarzakjes, en zwembad in HBSS.
4. Ontleden whisker follikels en zwembad in HBSS bij kamertemperatuur. Dit doen door de huid naast de haarfollikel met een pincet, en dan snijden rond de follikel met de rechte schaar. Snijden diep om te voorkomen dat verwonden haarzakjes.
5. Til snorhaar follikel uit whisker pad en in nieuwe bord met verse HBSS.
6. Spoelen losse adipous en huidweefsel met een spuit van de buffer, tot snorhaar follikels schoon zijn. Indien nodig, knip lef om whisker follikel en te verwijderen aanhangende weefsel door schrapen en herhaalde flushes van HBSS.
7. Pin schoon haar follilce op Sylgard-gecoat glas petrischaal met behulp van geslepen wolfraam naald, met behulp van microforceps voor het houden van op de huid gedeelte naast de follikel.
8. Snijd snorhaar follikel longitudically met een MicroBlade. Vermijd het snijden te diep, omdat dit de bobbel verwonden. Verwijder het bloed met herhaalde squirts van HBSS tot verdwenen. Uiterlijk van het bloed is een goede indicatie dat de snede was diep genoeg. Als de longitudial cut is niet lang genoeg, kan dit worden verlengd met gebogen microscissors.
9. Maak een dwarse snede boven het niveau van de holle sinus en vervolgens een tweede dwarse snede op het niveau binnen de ring sinus, dicht op de huid.
10. U ziet nu de bobbel in de capsule.
11. Pak een eind aan collageen capsule met het pincet en de roll-out van de uitstulping met een gebogen wolfraam naald. U ziet nu de lege capsule en de geïsoleerde bobbel.
12. Zwembad geïsoleerd uitstulpingen in een aparte cultuur plaat in HBSS bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat er geen ander weefsel is de gepoolde uitstulpingen vervuilende.

Cultuur van bobbel Explantaten

1. Coat 35 mm kweekplaten met collageen door het plaatsen van 50 pi collageen en 10 ul steriel 6% NaCl naast elkaar. Meng goed met een dubbel-gebogen Pasteyr pipet en duw naar de rand van de cultuur plaat. Incubeer overnacht in een schone exsiccator, maar niet laten drogen. Voor gebruik, spoel de borden met een zoutoplossing.
2. Pre-incubeer collageen gecoat en gespoeld cultuur platen voor ongeveer 3 uur met kweekmedium. Voedingsbodem bestaat voor 85% Alpha-gemodificeerde MEM, 10% foetaal runderserum en 5% dag 11 kippenembryo extract.
3. Na de re-incubatie, verwijder kweekmedium van de borden en voeg verschillende uitpuilt met zo weinig medium mogelijk. Verwijder overtollige kweekmedium.
4. Incubeer gedurende 1 uur, doch niet langer in cel incubator in een vochtige atmosfeer met 10% zuurstof en 5% CO _2.
5. Na 1 uur, voeg 1,5 ml van het kweekmedium. Uitstulping explantaten moeten zich houden aan het collageen ondergrond. Dagelijks vervangen door 50% van het kweekmedium.
6. Binnen 3 - 4 dagen, zal over grote afstanden trekkende cellen emigreren uit de bobbel explantaten. Let op hun stellaatcellen morfologie, de beweeglijkheid en de overheersende afwezigheid van cel-cel contacten. In de komende dagen zullen meer cellen emigreren, en emigreerde cellen zal snel vermenigvuldigen.
7. Verwijder uitstulping 2 - 3 dagen na het begin van EPI-NCSC emigratie met een scherpe wolfraam naald. Als de bulten worden langer gelaten, hebben ze de neiging om af te vlakken en het onmogelijk is om pure EPI-NCSC culturen krijgen te maken.
8. Belangrijk: Zeldzame cellen met afgeplatte morfologie, die zich soms zichtbaar enkele dagen later dan de EPI-NCSC, en die zijn minder beweeglijk zijn NIET EPI-NCSC, maar vermoedelijk epidermale stamcellen / voorlopers. Cultuur bestaat uit deze cellen, of gemengde culturen met EPI-NCSC en vermeende epidermale stamcellen / voorlopercellen moeten worden weggegooid.
9. Tip: Houd niet de cellen te lang in het primair explantatie medium, omdat ze de neiging om snel te differentiëren bij hoge celdichtheid, als gevolg van vermeende autocrien / paracriene groeifactor signalering.

Discussion

Op grond van hun vermogen tot migratie, kan EPI-NCSC worden geïsoleerd als een zeer zuivere populatie van stamcellen, die kunnen worden uitgebreid in vitro. Als embryonale resten in een volwassen locatie, EPI-NCSC zijn potentieel aantrekkelijke kandidaten voor toekomstige celvervangingstherapieën, biomedische engineering en / of de regeneratieve geneeskunde. We hebben getest EPI-NCSC in een muismodel van dwarslaesie, waar ze tonen wenselijke eigenschappen. Door middel van gen expressie profilering door LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, serie nummer GSE4680) hebben we laten zien dat, zoals verwacht, embryonale neurale lijst cellen en EPI-NCSC delen een soortgelijke genexpressie patroon dat afwijkt van dat van de naburige epidermale stamcellen en andere huid inwoner stamcellen / voorlopers.