Mus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) kulturer

Summary

Här visar vi vår metod för att isolera mus epidermala neurala celler crest stamceller (EPI-NCSC). Tekniken innebär att mikro-dissekera morrhår folliklar, isolera bula och placeing det i vävnadskultur. EPI-NCSC börja att emigrera från bula explants på underlaget inom 3 - 4 dagar.

Abstract

EPI-NCSC är resterna av embryonala neurala krönet på en vuxen läge, bula i hårsäckarna. De är multipotenta stamceller som har fysiologiska egenskapen att generera ett brett spektrum av differentierade celltyper, inklusive nervceller, nerv stödja celler, glatta muskler, ben / celler brosk och melanocyter. EPI-NCSC är lätt åtkomliga i den håriga huden och kan isoleras som en mycket ren population av stamceller. Den här videon ger en detaljerad protokoll för att förbereda mus EPI-NCSC kulturer från morrhår folliklar. Den morrhår pad av en vuxen mus tas bort, och morrhår folliklar dissekeras. Hårsäckarna skärs därefter längden och sedan tvärs över och under bula regionen. Utbuktningen tas bort från collagen kapseln och placeras i en kultur tallrik. EPI-NCSC börja att emigrera från bula explants 3 till 4 dagar senare.

Protocol

Dissektion av bucklan från Vuxen Folliklar Mus Whisker

1. Vi använder 10 veckor till 6 månader gamla möss. Yngre möss ger ofta flera celler. Euthanize mus och dränka hela djuret till 01:01 blandning av Betadine (jodlösning) och väteperoxid (finns på apotek) i ca 3 minuter.
   
2. Squirt hela musen, speciellt i ansiktet regionen, med 75% etanol, och bär mus till dissekering mikroskopet i laminärt flöde huva.
3. Dissekera morrhårskuddar, noggrant undvika att klippa i hårsäckarna och pool i HBSS.
4. Dissekera morrhår folliklar och pool i HBSS vid rumstemperatur. Gör detta genom att hålla huden intill hårsäcken med en pincett, och sedan skära runt follikeln med den raka saxen. Skär djupt för att undvika att skada hårsäckarna.
5. Lyft morrhår follikel av morrhår pad och tas i ny tallrik med färska HBSS.
6. Skölj lös adipous och dermal vävnad med squirts av buffert, tills morrhår folliklar är rena. Om det behövs, skär mage att morrhår follikeln och ta bort tillhörande vävnad genom att skrapa och upprepade spolningar av HBSS.
7. Pin rent hår follilce på Sylgard-belagt glas petriskål med vässade volfram nålar, med hjälp av microforceps för att hålla på huden delen intill hårsäcken.
8. Skär morrhår follikelstimulerande longitudically med microblade. Undvik att skära för djupt, eftersom detta kommer att skada bula. Ta bort blodet med upprepade sprutar av HBSS tills borta. Utseende av blod är en bra indikation på att skära var djup nog. Om longitudial skär inte är tillräckligt lång, kan det förlängas med böjda microscissors.
9. Gör ett tvärsnitt över den nivå av cavernous sinus och därefter en andra tvärgående snitt på samma nivå som i ringen sinus, nära huden.
10. Du kommer nu se bula inne i kapseln.
11. Ta ett slut för kollagen kapsel med pincett och rulla ut bula med en böjd volfram nål. Du kommer nu se den tomma kapseln och den isolerade bula.
12. Pool isolerade utbuktningar i en separat kultur platta i HBSS vid rumstemperatur. Se till att ingen annan vävnad förorenar poolade utbuktningar.

Kultur av bula explants

1. Coat 35 plattor mm kulturen med kollagen genom att 50 l kollagen och 10 l steril 6% NaCl bredvid varandra. Blanda väl med en dubbel-böjd Pasteyr pipett och tryck den mot kanten av kulturen plattan. Inkubera över natten i en ren exsickator, men låt inte torka. Före användning, skölj plattorna med koksaltlösning.
2. Pre-inkubera kollagen-belagda och sköljas odlingsplattor för ca 3 tim med odlingsmedium. Odlingsmedium består av 85% Alfa-modifierade MEM, 10% fetalt bovint serum och 5% dag 11 kycklingembryo extrakt.
3. Efter att åter inkubation, ta bort odlingsmedium från tallrikar och lägga till flera utbuktningar med så lite medel som möjligt. Ta bort överflödig odlingsmedium.
4. Inkubera i 1 timme, men inte längre, i cell inkubator i en fuktig atmosfär med 10% syre och 5% CO _2.
5. Efter 1 timme, försiktigt lägga 1,5 ml odlingsmedium. Bula explants bör ansluta sig till kollagen underlaget. Byt ut 50% av odlingsmedium dagligen.
6. Inom 3 - 4 dagar, kommer långvandrande celler emigrera från bula explants. Notera deras stellatum morfologi, motilitet och dominerande avsaknad av cell-cell kontakter. Under de närmaste dagarna kommer flera celler emigrera, och emigrerade celler förökar sig snabbt.
7. Ta bort bula 2 - 3 dagar efter debut av EPI-NCSC utvandringen med en vass volfram nål. Om utbuktningar är kvar längre, de tenderar att platta till och göra det omöjligt att få rena EPI-NCSC kulturer.
8. Viktigt: Sällsynta celler med tillplattade morfologi, som blir ibland uppenbara flera dagar senare än EPI-NCSC, och som är mindre rörliga är INTE EPI-NCSC, men förmodad epidermala stamceller / stamceller. Kulturer som består av dessa celler, eller blandade kulturer innehåller EPI-NCSC och möjliga epidermala stamceller / stamceller måste kasseras.
9. Tips: Håll inte cellerna för länge i primär Explantation medium, eftersom de tenderar att differentiera snabbt vid hög celltäthet, förment grund autokrin / parakrina tillväxtfaktor signalering.

Discussion

I kraft av sin vandrande förmåga, kan EPI-NCSC vara isolerade som en mycket ren population av stamceller, som kan expanderas in vitro. Som embryonala rester i en vuxen plats, EPI-NCSC är potentiellt attraktiva kandidater för framtida cellterapi ersättning, medicinsk teknik och / eller regenerativ medicin. Vi har testat EPI-NCSC i en musmodell av ryggmärgsskada, där de visar önskvärda egenskaper. Genom profilering av genuttryck med LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, serienummer GSE4680) visade vi att, som väntat, embryonala neurallist celler och EPI-NCSC delar ett liknande mönster genuttryck som skiljer sig från angränsande epidermala stamceller och andra hud bosatt stamceller / stamceller.