Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

Summary

Aquí mostramos nuestro método para aislar la epidermis del ratón las células nerviosas troncales de la cresta (EPI-NCSC). Técnica consiste en micro-disección de folículos bigotes, aislar el bulto y placeing que en el cultivo de tejidos. EPI-NCSC comienzan a emigrar a partir de explantes bulto en el sustrato dentro de 3 a 4 días.

Abstract

EPI-NCSC son los restos de la cresta neural embrionaria en un lugar para adultos, el bulto de los folículos pilosos. Son las células madre multipotenciales que tienen la propiedad fisiológica para generar una amplia gama de tipos de células diferenciadas, incluidas las neuronas, las células nerviosas de soporte, las células del músculo liso, el hueso / células del cartílago y los melanocitos. EPI-NCSC son fácilmente accesibles en el cuero cabelludo y puede ser aislada como una población muy pura de células madre. Este video ofrece un protocolo detallado para la preparación de ratón EPI-NCSC culturas de los folículos de los bigotes. La almohadilla de los bigotes de un ratón adulto se retira, y se diseca folículos bigotes. Los folículos son cortados longitudinalmente y transversalmente posteriormente por encima y por debajo de la región bulto. El bulto se retira de la cápsula de colágeno y se colocan en una placa de cultivo. EPI-NCSC comienzan a emigrar de los explantes bulto 3 a 4 días después.

Protocol

La disección de las Ardenas de adultos folículos ratón bigote

1. Utilizamos 10 semanas a 6 meses de edad los ratones. Ratones más jóvenes a menudo producen más células. La eutanasia de animales de ratón y sumergir todo en una mezcla 1:1 de betadine (solución de yodo) y peróxido de hidrógeno (disponible en farmacias) durante unos 3 minutos.
   
2. Squirt ratón entero, especialmente en la región facial, con un 75% de etanol, y llevar el ratón para microscopio de disección en la campana de flujo laminar.
3. Diseccionar las almohadillas bigotes, evitando cuidadosamente el corte en los bulbos pilosos, y la piscina en HBSS.
4. Diseccionar los folículos bigotes y una piscina en HBSS a temperatura ambiente. Para ello, la celebración de la piel junto al folículo del pelo con una pinza, a continuación, cortar alrededor de los folículos con las tijeras rectas. Penetran profundamente para evitar lesiones en los bulbos pilosos.
5. Levante folículo bigotes fuera de la almohadilla de los bigotes y puesto en la nueva placa con HBSS fresco.
6. Ras adiposo sueltos y tejido dérmico con chorros de tampón, hasta los folículos bigotes están limpios. Si es necesario, cortar los nervios a los folículos bigotes y eliminar el tejido adherente y los colores mediante el raspado repetido de HBSS.
7. Pin follilce pelo limpio en Sylgard de vidrio recubiertos de una placa de Petri con afiladas agujas de tungsteno, utilizando microforceps para la celebración en la parte de piel al lado del folículo.
8. Bigote de corte con un folículo longitudically MicroBlade. Evitar cortar demasiado profundamente, ya que esto dañará el bulto. Eliminar la sangre con chorros repetida de HBSS hasta desaparecido. Aparición de sangre es un buen indicio de que el corte fue bastante profundo. Si el corte longitudial no es lo suficientemente largo, que puede alargarse con micro tijeras dobladas.
9. Haga un corte transversal por encima del nivel del seno cavernoso y posteriormente un segundo corte transversal en el nivel en el seno del anillo, cerca de la piel.
10. Ahora podrá ver el bulto dentro de la cápsula.
11. Hazte con un final de la cápsula de colágeno con la pinza y poner en práctica el bulto con una aguja de tungsteno dobladas. Ahora verá la cápsula vacía y el bulto aislado.
12. Piscina aislados protuberancias en una placa de cultivo por separado en HBSS a temperatura ambiente. Asegúrese de que ningún otro tejido está contaminando los bultos agrupados.

Cultura de explantes bulto

1. Escudo 35 mm y placas de cultivo con el colágeno mediante la colocación de 50 l de colágeno y 10 l estéril 6% NaCl uno junto al otro. Mezclar bien con una pipeta de doble inclinación Pasteyr y empuje hacia el borde de la placa de cultivo. Incubar toda la noche en un desecador limpio, pero no deje que se seque. Antes de su uso, enjuague los platos con solución salina.
2. Preincubarlos colágeno recubiertas y se lava las placas de cultivo de aproximadamente 3 horas con medio de cultivo. El medio de cultivo consiste en un 85% de alfa-MEM modificado, el 10% de suero fetal bovino y 5% el día 11 de extracto de embrión de pollo.
3. Después de re-incubación, se elimina el medio de cultivo de las placas y añadir varios bultos con un medio tan poco como sea posible. Retire el exceso de medio de cultivo.
4. Incubar durante 1 hora, pero ya no, en la celda incubadora en una atmósfera húmeda con 10% de oxígeno y 5% de CO _2.
5. Después de 1 hora, añadir con cuidado 1,5 ml de medio de cultivo. Explantes de bombeo debe cumplir con el sustrato de colágeno. Reemplazar el 50% del medio de cultivo todos los días.
6. Dentro de 3 a 4 días, las células altamente migratorias emigrar de los explantes bulto. Tenga en cuenta su morfología estrellada, la movilidad, y la ausencia predominante de contactos célula-célula. En los próximos días, más células emigren, y emigró células proliferan rápidamente.
7. Quitar bulto 2 a 3 días después del inicio de EPI-NCSC emigración con una aguja de tungsteno afilada. Si los bultos se quedan más tiempo, tienden a aplanarse y hacen que sea imposible obtener puro EPI-NCSC culturas.
8. Importante: las células raras con una morfología aplanada, que se convierten a veces aparente durante varios días más tarde de EPI-NCSC, y que son menos móviles son EPI-NO NCSC, pero supuestas células madre epidérmicas / progenitores. Culturas que consta de estas células, o mezcla de culturas que contienen EPI-NCSC y la posible existencia de células madre epidérmicas / progenitores deben ser desechados.
9. Sugerencia: No mantener las células durante mucho tiempo en un medio de explante primario, ya que tienden a diferenciar rápidamente a alta densidad celular, supuestamente debido a autocrina / paracrina de señalización del factor de crecimiento.

Discussion

En virtud de su capacidad migratoria, EPI-NCSC se puede aislar como una población de alta pureza de las células madre, que pueden ser expandidas in vitro. Como restos de embriones en un lugar para adultos, EPI-NCSC son candidatos potencialmente atractivo para el futuro de las terapias de reemplazo celular, ingeniería biomédica y / o la medicina regenerativa. Hemos probado EPI-NCSC en un modelo murino de lesión de la médula espinal, donde se muestran las características deseables. A través de perfiles de expresión génica por LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, número de serie GSE4680) puso de manifiesto que, como era de esperar, las células embrionarias de la cresta neural y EPI-NCSC comparten un patrón de expresión de genes similares que difiere de la de vecinos las células madre epidérmicas de la piel y las células madre residente / progenitores.